LepR 3′UTR缺失导致CreER工具鼠示踪特征改变的研究

目的 构建瘦素受体（Leptin receptor,LepR）报告基因（LepR-CreER）小鼠,在体内研究LepR 3′ UTR中引入polyA对骨关节和其他脏器中LepR基因表达模式的影响。方法 通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在LepR基因终止密码子前定点敲入2A-CreERT2-WPER-polyA表达框,构建诱导型LepR-CreER基因小鼠,与R26tdTomato小鼠杂交繁育,获得LepR-CreER;R26tdTomato基因小鼠,提取小鼠组织DNA,采用PCR进行基因型鉴定。对幼龄及成年期LepR-CreER;R26tdTomato基因小鼠的骨关节和脏器组织进行冰冻切片,利用DAPI和免疫荧光染色检测体内LepR+细胞表达情况,并与LepR-Cre;R26tdTomato小鼠LepR+细胞表达进行比较。在LepR-Cre和LepR-CreER小鼠关节腔注射Leptin重组蛋白,采用Safranin O染色和Aggrecan免疫荧光染色观察关节软骨的变化。结果 幼龄期,LepR-CreER;R26tdTomato和LepR-Cre;R26tdTomato小鼠的生长板肥大区及骨髓中均有LepR+细胞存在,关节软骨中没有LepR+细胞的出现;而成年期,LepR-CreER;R26tdTomato小鼠关节软骨中LepR+细胞的数目较LepR-Cre;R26tdTomato小鼠明显增多,阳性细胞分布范围扩大。关节腔注射Leptin后,LepR-CreER小鼠较LepR-Cre小鼠出现更严重的关节软骨退变表现。进一步生物信息学及表达对比分析发现LepR基因的3′UTR存在关节软骨中高表达的miR-31-5p互补结合位点。结论 成年期,不同方式构建的LepR报告基因小鼠中LepR+细胞表达具有差异,激活异位表达LepR+细胞的关节软骨出现更严重的骨关节炎,生信分析提示其中的差异可能源自LepR基因3′UTR存在miR-31-5p的潜在结合区域。