电离辐射后小鼠骨髓组成中结合珠蛋白的表达规律研究

目的研究照射前后结合珠蛋白在小鼠骨髓中的表达和分布，及其与骨髓细胞周期进程改变及凋亡的可能关联。方法用RT-PCR，Western blotting及流式细胞术的方法检测骨髓细胞Hp mRNA及细胞内外Hp蛋白的存在，及其辐射后的变化。用流式细胞术的方法分析了骨髓细胞中Hp阴性及阳性细胞群周期分布及凋亡率的差异。结果在骨髓细胞中检测到Hp mRNA的存在，而且8Gy照射后24h较正常小鼠有明显升高。骨髓细胞内及外液中检测到Hp蛋白的存在，同样8Gy照射后24h较正常小鼠亦呈明显升高。流式细胞术检测发现小鼠骨髓细胞中部分细胞含有Hp蛋白，照射后Hp阳性细胞的比例逐渐增加，并有着较好的时效关系和剂量依赖关系。骨髓Hp阳性细胞与阴性细胞的细胞周期分布存在显著的差异。在照射后6h骨髓细胞凋亡率随照射剂量增加而明显增加，而Hp^ 细胞凋亡率增加不明显。结论小鼠骨髓组织中可以检测到结合珠蛋白的存在，并且在辐射后有明显的增加，骨髓细胞中Hp阴、阳性细胞的周期分布和凋亡存在明显的差异。推测Hp可能参与辐射诱导骨髓损伤的修复过程。     

一种新的GFP/DNA双标记流式细胞技术

目的：为了检测细胞转染了带绿色荧光蛋白(GFP)标记的融合基因后细胞周期的改变，以研究目的基因与细胞周期的关系，建立GFP／DNA双标记流式细胞技术。方法：①以小鼠脾细胞为模型，以不同浓度的多聚甲醛(PFA)预固定细胞不同时间，再换用70％乙醇固定细胞24h以上，观察不同固定方法对细胞周期检测的影响；②以Ad-EGFP感染的Hep-2细胞为模型，观察不同固定方法对细胞周期、GFP阳性细胞检出率和GFP的荧光强度的影响；③用最佳固定方法观察转染p21／WAF1／CIP1-EGFP融合基因的293细胞的细胞周期，以验证方法的可靠性。结果：0．5％PFA预固定60min，再换用70％乙醇固定细胞，不影响细胞周期检测，而且GFP荧光强度和转染效率的检测最佳。以此方法固定细胞，GFP／DNA双标记流式细胞技术检测了转染p21／WAF1／CIP1-EGFP融合基因的293细胞的细胞周期，可观察到p21表达阳性的细胞发生了G0／G1期阻滞。结论：优化的细胞固定方法可以有效地阻止GFP从细胞内流出，建立的GFP／NDA双标记流式细胞技术可以用于研究带GFP标签的基因表达蛋白与细胞周期的关系。     

γ射线诱导人单核细胞系THP-1细胞结合珠蛋白的表达

目的 探讨γ射线诱导THP-1细胞中结合珠蛋白的表达及调控的机制.方法 RT-PCR和Western blot检测结合珠蛋白mRNA和蛋白的变化.EMSA检测γ射线照射后THP-1细胞核提取物中与结合珠蛋白启动子区域寡聚核苷酸探针复合物的形成,抗体阻滞实验检测可能参与复合物形成的转录因子.结果 γ射线能够诱导THP-1细胞中结合珠蛋白的表达,而且有时间和剂量依赖效应,分别包含结合珠蛋白启动子区域的3个不同顺式作用元件的寡聚核苷酸探针均能与核提取物形成复合物,其中B和C区域的复合物形成受γ射线影响明显,stat-3在γ射线照射后表达升高,C/EBPβ-LIP出现先升高而后下降的过程.抗体阻滞实验中Anti-C/EBPα和Anti-C/EBPβ抗体能够形成明显的超迁移条带,Anti-stat3能够影响细胞核提取物与寡聚核苷酸探针复合物的形成.结论 γ射线能够诱导THP-1细胞中结合珠蛋白的表达,C/EBPβ-LIP和stat-3参与了其中的调控过程.     

大剂量γ射线照射后PC12细胞死亡方式的研究

目的 研究受大剂量γ射线作用后,大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）的死亡方式,寻找神经细胞辐射损伤的体外模型.方法 PC12细胞分为0、8、16和32 Gy组,经60 Co γ射线照射后,PI单染流式细胞术法观察细胞增殖周期改变,Annexin-V-FITC及PI双染法检测细胞凋亡的发生,光镜和电镜技术观察照射后细胞分化与存活的形态学变化.结果 大剂量γ射线照射后,随照射剂量的加大,发生死亡的细胞数有所增加,但发生凋亡的PC12细胞数目很少,可以忽略不计;细胞主要是在肿胀的基础上发生死亡的.电镜显示,细胞器明显肿胀扩张,粗面内质网高度扩张,线粒体肿胀、空化,核染色质浓缩成块状,散在于核膜下及核仁周围,核膜间隙增宽,与胀亡性坏死的特征相类似.结论 大剂量γ射线照射后,PC12细胞主要是在肿胀的基础上发生死亡的.该细胞模型适于被用来研究辐射致神经细胞坏死相关病理生理过程及其内在机制等问题.     

γ射线全身照射小鼠后结合珠蛋白表达变化的研究

目的 研究小鼠受到不同剂量全身照射后血清和主要造血免疫器官中结合珠蛋白的表达,寻找可能的放射病诊断指标和治疗靶点。方法 运用Western blotting 检测照射后小鼠血清中结合珠蛋白的变化,RT-PCR检测照射后小鼠器官组织中结合珠蛋白mRNA 的表达情况。结果 照射后小鼠血清中结合珠蛋白和免疫造血相关组织中结合珠蛋白mRNA均较正常对照升高,而且随着照射后时间和照射剂量的增加出现了增加趋势。结论 电离辐射可以引起小鼠血清中结合珠蛋白和造血免疫相关组织中结合珠蛋白mRNA的增加,可能是急性放射损伤诊断的新指标和治疗新靶点。     

γ射线与LPS作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7的生物学效应

目的: 研究γ射线与LPS协同激活小鼠巨噬细胞RAW264.7的效应机制, 以及γ射线与LPS诱导钙结合蛋白S100A8的表达及意义.方法: 相差显微镜观察细胞形态; 流式细胞计数方法检测细胞周期及活性氧介质(ROI)水平; Griess颜色反应测定细胞NO水平; 实时定量RT-PCR方法检测细胞S100A8 mRNA水平的表达.结果: γ射线与LPS作用于RAW264.7细胞引起细胞形态改变, 部分细胞出现非整倍性, 少量细胞出现凋亡, 胞内ROI水平、 NO水平明显升高, S100A8 分子mRNA水平明显升高, 而且这些效应几乎都比?射线或LPS单因素的作用要强.结论: γ射线与LPS协同诱导巨噬细胞激活是细胞周期改变、信使分子水平变化、炎症因子如S100A8的表达等多方面生物效应的综合结果, 其中S100A8基因的表达与巨噬细胞功能状态密切相关.     

小鼠受γ射线全身照射后FL表达变化的研究

目的 FL(fit3 ligand)是一种作用于早期造血细胞的生长因子，为进一步研究FL水平与辐射所致造血损伤的相关性，观察了小鼠受γ射线全身照射后FL的表达变化。方法以^60Coγ射线全身一次性均匀照射所致骨髓型急性放射病小鼠为模型，应用ELISA、流式细胞术、Western blot法检测照射前后小鼠外周血、骨髓、胸腺与脾脏中FL的表达变化。结果 小鼠受2～10Gyγ射线照射后24h，血清中FL浓度即有增加，并且随时间推移FL水平逐渐升高；吸收剂量在2～6Gy之间时，FL的水平随剂量增加而增加。6Gyγ射线照射后24h，外周血白细胞膜表面FL的表达增加，但24h后细胞膜表面FL的表达没有升高。6Gyγ射线照射后24h，骨髓、胸腺和脾脏有核细胞膜表面FL的表达明显升高，总蛋白中FL的水平亦明显增加。结论 辐射后早期小鼠FL可溶性与膜结合型蛋白的水平都有升高，而且辐射后血清中FL的水平与受照剂量及照射后时间存在相关性。     

电离辐射诱导PC12细胞分化的蛋白质组学分析

目的探索辐射诱导PC12细胞分化的分子机理，筛选神经系统辐射损伤的分子靶标。方法16Gyγ射线照射PC12细胞，照射48h，提取正常与照射后细胞总蛋白，进行双向电泳分析，并对部分差异表达蛋白质进行质谱鉴定。结果电泳中共发现差异表达蛋白质位点876个。鉴定出表达水平增高的蛋白泛素羧端水解酶L1，表达水平降低的蛋白HP1α类似蛋白。结论应用蛋白质组技术鉴定出部分辐射后差异表达蛋白质，为辐射诱导PC12细胞分化的分子机理研究提供了线索。     

STAT3 siRNA引起U251细胞凋亡的研究

目的:观察利用siRNA技术下调人脑胶质母细胞瘤细胞(U251)STAT3表达后对细胞凋亡的影响. 方法:分离培养并间接免疫荧光鉴定大鼠原代星形胶质细胞(NA),用STAT3干涉质粒载体(pSilence2.1-STAT3)及对照载体(pSilence2.1-GFP)转染U251细胞及NA细胞,用Hoechst 33258染色观察凋亡的形态学改变,用Annexin-V试剂盒定量检测凋亡.结果:分离培养了符合实验要求的NA细胞,转染pSilence2.1-STAT3后,U251细胞出现了明显的时间依赖性细胞凋亡,而NA细胞无显著凋亡发生.结论:pSilence2.1-STAT3能诱导U251细胞凋亡,而对正常细胞无显著影响.     

微孔板稀释法在活菌培养计数中的应用观察

摘要 目的 <\b> 以96孔板微量稀释法代替传统试管稀释法建立了新的活菌计数方法（也简称新方法或96孔板计数法）,通过两种活菌培养计数方法的比较,验证新方法的准确性、快捷性。方法 <\b>　对新方法的不同吹吸次数进行比较,选择最佳的吹吸次数。用两种活菌培养计数方法同时对同一管枯草杆菌黑色变种芽孢悬液进行计数,验证新方法的准确性;不同实验技术人员同时对同一管枯草杆菌黑色变种芽孢悬液用96孔板进行系列稀释,用滴液计数法计数,比较不同人员操作的误差率;用两种活菌培养计数方法对同一种消毒剂进行中和剂鉴定试验,验证新方法在消毒效果检测中应用的可行性。结果 <\b> 经不同吹吸次数的误差率比较,20次为最佳吹吸次数;96孔板微量计数法对枯草杆菌黑色变种芽孢悬液计数结果与传统方法计数结果一致;3名不同实验技术人员采用新方法同时对一管菌悬液计数,3人之间的误差率为1.69%,符合2002年版《消毒技术规范》要求,且误差率远低于新入职实验技术人员用传统方法对枯草杆菌黑色变种芽孢悬液活菌培养计数结果;在一种消毒剂的中和剂鉴定试验中,新方法与传统方法活菌培养计数结果一致。结论 <\b> 新的活菌计数法计数结果与传统活菌培养计数结果一致,且不同实验技术人员之间的误差率很小,新的培养计数方法可以应用到消毒剂悬液定量杀菌试验中,且采用新的培养计数方法更方便、快捷,节省时间,对实验人员技术要求不高,适合进一步推广。