HIV-1 Tat通过抑制启动子活性调控MCAK基因表达

目的验证HIV-1Tat对有丝分裂着丝点关联驱动蛋白MCAK基因表达的调节作用并探讨其分子机制。方法利用表达Tat的人横纹肌肉瘤细胞(TE671)模型及原核表达纯化的Tat蛋白,通过Northern印迹法和蛋白印迹技术验证HIV-1 Tat对MCAK基因表达的抑制作用。PCR扩增MCAK基因各启动区片段,与荧光素酶报告质粒相连接,并转染到TE671细胞,通过荧光素活性分析法检测DNA片段启动活性,确定MCAK基因的活性启动区域。进一步通过HIV-1Tat与MCAK启动区作用,分析Tat对启动子活性的调控作用。结果Northern印迹和蛋白印迹结果证实Tat蛋白对MCAK转录、翻译水平的表达都有强烈的抑制作用;荧光报告质粒检测系统分析表明MCAK的核心启动区存在于-399～+1bp区域,且其启动子活性在Tat存在的情况下受到明显的抑制。结论HIV-1 Tat能作用于MCAK基因启动区-399～+1bp区域,导致MCAK启动子活性降低,从而抑制MCAK基因的表达。     

乙型肝炎病毒与宿主细胞蛋白相互作用的研究进展

乙肝病毒感染是肝癌的主要诱因之一。最近几年的研究重点是病毒的组分与宿主细胞因子之间的相互作用。越来越多的与病毒有相互作用的细胞因子被发现，这可能意味着乙肝病毒复制的每一个步骤都有许多宿主细胞因子参与。本文将讨论近年来这方面的研究进展，并对乙肝病毒感染尚未解决的问题进行讨论。     

60Co γ射线诱导正常人淋巴母细胞PIG3 基因mRNA表达的剂量相关性研究

目的 探讨正常人淋巴母细胞AHH1电离辐射作用后PIG3基因mRNA表达变化的剂量-效应规律,建立一种基于基因表达变化的新型辐射生物剂量计的可能性。方法 激光共聚焦检测DNA双链断裂分子标记γ-H2AX集簇点,1、2、4、6、8和10 Gy ⁶⁰Co γ射线照射AHH1细胞后4、10和24 h收集细胞,应用实时荧光定量PCR技术对PIG3基因mRNA表达水平进行相对定量检测。结果 γ射线照射后30 min检测发现PIG3蛋白与γ-H2AX在细胞核内有部分共定位,形成集簇点(foci),表明其参与电离辐射致DNA双链断裂损伤信号识别反应。γ射线诱导PIG3基因 mRNA表达水平随时间推移不断提高,持续时间可达24 h。PIG3基因mRNA表达水平具有显著的剂量依赖性,其表达丰度变化的剂量依赖范围在照射后4 h为0~ 6 Gy、照射后10和24 h均为0~10 Gy。结论 PIG3基因参与DNA双链断裂损伤信号识别反应,其mRNA的辐射诱导表达具有良好的剂量-效应关系,具有发展成为新的放射生物剂量计的价值。     

6-溴异香兰素对HeLa细胞的增殖抑制及放射增敏作用

目的研究香兰素衍生物中的6-溴异香兰素（6-溴-5-羟基-4-甲氧基苯甲醛,BVAN08）对HeLa细胞增殖和放射敏感性的影响,为开发新的抗癌和放射增敏药物提供理论依据。方法利用MTT法检测细胞增殖,单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤,流式细胞术检测细胞周期,克隆形成率法检测细胞放射敏感性,AnnexinⅤ/PI染色法检测细胞凋亡。结果研究表明BVAN08在10～20μmol/L以上浓度就显示出对HeLa细胞增殖的抑制作用,抑制程度具有剂量依赖性,抑制细胞存活的IC50值为19.07μmol/L。BVAN08能诱发细胞DNA双链断裂损伤,作用4h就开始诱发细胞周期G2/M阻滞,随时间延长阻滞更加明显。BVAN08明显降低DNA修复蛋白DNA-PKcs的表达水平,20μmol/LBVAN08与2Gyγ射线复合作用可以显著增加细胞对射线的敏感性,增加细胞凋亡率。结论 BVAN08抑制HeLa细胞增殖,提高细胞的放射敏感性,其放射增敏作用与降低DNA-PKcs蛋白表达水平和G2/M阻滞有关。     

香兰素衍生物VND3207对不同LET辐射致质粒DNA损伤的防护作用

目的 评价不同LET辐射致DNA损伤以及药物的防护作用.方法 分别以60Co γ射线、质子束、7Li重离子束照射溶液状态超螺旋构象质粒DNA,通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子构象变化,检测DNA损伤程度及VND3207的防护作用.结果 质子和7Li重离子体外所致质粒DNA损伤明显比γ射线严重.药物VND3207能够有效减轻所观察的3种不同LET辐射对质粒DNA的损伤,加药组与不加药组相比,质粒DNA开环构象显著减少,保护效果随着药物浓度的增加更加明显.200 μmol/L浓度对50 Gy γ射线、质粒和7Li重离子辐照质粒DNA损伤的保护效果(质粒超螺旋构象百分比)分别为85.3%(t=3.70,P=0.033)、73.3%(t=10.58,P=0.017)和80.4%(t=8.57,P=0.008).可见VND3207对重离子辐射损伤的保护效应尤为显著,明显优于质子辐照损伤.结论 药物VND3207对辐射DNA损伤具有较好的保护作用,特别是对γ射线和重离子辐射损伤的保护作用更为明显.

Abstract：

Objective To evaluate the radioprotective effect of vanillin derivative VND3207 on DNA damage induced by different LET ionizing radiation.Methods The plasmid DNA in liquid was irradiated by 60Co γ-rays, proton or 7Li heavy ion with or without VND3207.The conformation changes of plasmid DNA were assessed by agarose gel electrophoresis and the quantification was done using gel imaging system.Results The DNA damage induced by proton and 7Li heavy ion was much more serious as compared with that by 60Co γ-rays, and the vanillin derivative VND3207 could efficiently decrease the DNA damage induced by all three types of irradiation sources, which was expressed as a significantly reduced ratio of open circular form (OC) of plasmid DNA.The radioprotective effect of VND3207 increased with the increasing of drug concentration.The protective efficiencies of 200 μmol/L VND3207 were 85.3% (t =3.70,P =0.033), 73.3% (t = 10.58, P =0.017)and 80.4% (t =8.57,P =0.008)on DNA damage induction by 50 Gy of γ-rays, proton and 7Li heavy ion, respectively.It seemed that the radioprotection of VND3207 was more effective on DNA damage induced by high LET heavy ion than that by proton.Conclusions VND3207 has a protective effect against the genotoxicity of different LET ionizing radiation, especially for γ-rays and 7 Li heavy ion.     

转录反式激活因子对DNA-PKcs启动子的调控作用

目的 检测人类免疫缺陷病毒转录反式激活因子( TAT)对DNA依赖蛋白激酶催化亚单位( DN A-PKcs)基因启动子活性的影响.方法 用PCR方法克隆DNA-PKcs基因启动子的系列截短体,通过DNA重组构建pGL3-basic-DN A-PKcs肩动子报告质粒载体,通过双荧光素酶报告基因检测DNA-PKcs基因的肩动子活性,采用基于乳糖抑制子和乳糖操纵子并结合绿色荧光蛋白分子荧光的大规模染色质松弛报告系统观察染色质的重构活性,并研究了电离辐射对TAT参与染色体重构的影响.结果构建了DNA-PKcs启动子(全长区域为-939 bp～-1 bp)的系列截短体的报告质粒载体,鉴定出其核心区域为-64 bp～-1 bp.TAT能够抑制DNA-PKcs基因启动子的转录活性.TAT具有大规模的染色体松弛活性,电离辐射能抑制TAT参与染色体重构的作用.结论 TAT能抑制DNA修复基因DNA-PKcs的启动子活性,电离辐射能抑制TAT参与染色体重构的作用.     

肝癌组织DNA-PKcs过量表达及其靶向siRNA分子的抗增殖作用

目的:研究肝癌组织中DNA依赖蛋白激酶催化亚基DNA-PKcs的表达差异及其生物学意义.方法:用组织芯片和免疫组化法检测肝胆癌组织86例,肝胆管结石切除肝组织17例标本和正常肝组织70例中DNA-PKcs蛋白表达情况,Western blot检测培养细胞中DNA-PKcs表达,Lipofectamine 2000介导DNA-PKcs的siRNA质粒DNA转染,细胞生长曲线分析细胞增殖,克隆形成法分析细胞辐射敏感性.结果:组织芯片检测显示,60例肝癌组织细胞中DNA-PKcs阳性表达率<25%(极低表达),25%-50%(低表达),51%-75%(中等表达)和>75%(高表达)分别占15%,20%,23.3%和41.7%,而64例正常肝组织中各DNA-PKcs阳性表达率分别为68.7%,10.9%,12.6%和7.8%,表明癌组织DNA-PKcs的表达水平显著高于正常组织(P=0.0008).26例肝癌组织病理切片的免疫组化结果也显示,其DNA-PKcs表达水平显著高于23例非肿瘤性肝组织(P= 0.001).Western blot检测结果显示,体外培养的肝癌细胞HepG2,7721和7402中DNA-PKcs表达水平,同样显著高于正常肝细胞LO2.siRNA分子靶向抑制DNA-PKcs表达,不但显著提高HepG2细胞对电离辐射的敏感性,同时还降低肝癌细胞的增殖速度.随着DNA-PKcs表达的抑制,癌基因c-Myc蛋白表达水平也显著降低.结论:肝癌组织细胞中DNA-PKcs表达水平显著高于正常肝组织和非肿瘤性肝病理组织,siRNA抑制DNA-PKcs表达,具有抗癌细胞增殖和放射增敏作用,c-Myc蛋白表达抑制可能是其抗增殖作用的相关机制之一.     

Tip60基因沉默对细胞DNA双链断裂修复和辐射敏感性的影响

目的 探讨Tip60对细胞辐射敏感性的影响及相关机制。方法 采用siRNA和Tip60乙酰转移酶抑制剂漆树酸,抑制U2OS细胞中Tip60的表达或乙酰转移酶活性;用克隆形成率分析细胞对⁶⁰Co γ射线的敏感性;采用γ-H2AX原位免疫荧光集簇点法,检测DNA双链断裂损伤修复;用免疫共沉淀检测蛋白质的相互作用。结果 siRNA沉默Tip60表达明显提高了U2OS细胞对1、2 Gy中、低剂量γ射线的敏感性(t=3.364、3.979,P＜0.05),但对4 Gy大剂量照射的细胞存活率无明显影响。γ-H2AX集簇点检测结果表明,照射后1、4和8 h,Tip60失活导致细胞DNA双链断裂修复能力降低(t=3.875、3.183和3.175, P<0.05)。细胞在受到电离辐射损伤后,Tip60与DNA修复蛋白DNA-PKcs发生相互作用,漆树酸能抑制DNA-PKcs的T2609位点的磷酸化。结论 Tip60通过与DNA-PKcs相互作用,调控细胞DNA双链断裂修复机制,对细胞辐射敏感性产生影响。