大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。 目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。 方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。 结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。     

干细胞治疗在帕金森病中的应用

帕金森病(PD)是常见于中老年人的慢性进行性神经系统退行性疾病,目前虽然有多种方法可用于缓解其症状,如长期药物治疗、外科手术治疗等,但是这些方法因为治疗效果有限、并发症严重而难以推广和应用.近年来应用干细胞移植治疗PD得到了越来越多的关注.因此,本文将就不同类型干细胞的生物学特性,定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法,移植治疗PD的基础研究进展和临床探索以厦移植治疗的局限性进行综述,旨在为干细胞移植治疗PD提供科学依据.     

MPP对培养中脑多巴胺能神经元的影响

目的:通过观察MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺及胆碱摄取能力、多巴胺含量变化及细胞形态的改变等,研究MPP+对中脑多巴胺能神经元功能的影响,探讨利用MPP+建立体外PD细胞模型的可能性及实际意义.方法:用孕14天Wistar大鼠,氯胺酮麻醉后取胚胎,按本室常规方法分离培养中脑多巴胺能神经元,培养至第7天后将不同浓度的MPP+加入培养有神经元的培养基中,使其终浓度分别为0.1μM,1μM,10μM.分别测定不同时相点[3H]多巴胺和[3H]胆碱摄取能力及细胞内多巴胺含量变化,并进行TH免疫细胞化学染色.结果:MPP+浓度为0.1μM、1μM和10μM时,其[3H]多巴胺摄取力分别是为6.2±0.7、5.9±0.5、5.4±04,较之对照组100±1.7的结果看,MPP+对中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显抑制作用(P＜0.05);而[3H]胆碱摄取力其值为98±3.1,较之对照组100±2.4,差异不显著,说明MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取力无抑制作用(P＞0.05).另一个有趣的结果是胶质细胞的存在对MPP+的作用有明显影响,未抑制胶质细胞组其作用明显强于抑制胶质细胞组(P＜0.05);同时MPP+使中脑多巴胺能神经元细胞内多巴胺含量明显减少(P＜0.05);TH阳性细胞明显减少(P＜0.05).结论:MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显的抑制作用,不仅使多巴胺的摄取降低,而且细胞内的多巴胺含量也显著减少,TH免疫组化染色结果也支持这一结果.MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取能力无明显抑制作用.     

炎症反应在帕金森病中的研究进展

帕金森病(PD)是常见的中枢神经系统变性疾病,以黑质和纹状体多巴胺能神经元进行性缺失为主要病理改变,其病因和发病机制不明。近年来,炎症反应能够导致多巴胺能神经元变性、死亡的研究引起人们广泛关注。非甾体类药物的抗炎症反应作用可延缓PD的进展。炎症反应在PD中的作用研究已成为该领域新的研究热点。本文介绍炎症反应在PD中的作用以及研究进展。     

北京市50例正常男性汉族SRY基因多态性的研究

目的筛查中国人群是否存在SRY基因变异,探讨SRY基因变异是否与PD有关。方法通过聚合酶链式反应、变性高效液相色谱测序方法对北京市50例正常男性汉族SRY基因的rs3583729、rs11575897及启动子区进行检测。结果所有DNA标本的PCR产物均未发现基因变异。结论 SRY基因是比较保守的基因,没发现相关多态性位点。     

MPP+对培养中脑多巴胺能神经元的影响

目的通过观察MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺及胆碱摄取能力、多巴胺含量变化及细胞形态的改变等,研究MPP+对中脑多巴胺能神经元功能的影响,探讨利用MPP+建立体外PD细胞模型的可能性及实际意义.方法用孕14天Wistar大鼠,氯胺酮麻醉后取胚胎,按本室常规方法分离培养中脑多巴胺能神经元,培养至第7天后将不同浓度的MPP+加入培养有神经元的培养基中,使其终浓度分别为0.1μM,1μM,10μM.分别测定不同时相点[3H]多巴胺和[3H]胆碱摄取能力及细胞内多巴胺含量变化,并进行TH免疫细胞化学染色.结果MPP+浓度为0.1μM、1μM和10μM时,其[3H]多巴胺摄取力分别是为6.2±0.7、5.9±0.5、5.4±04,较之对照组100±1.7的结果看,MPP+对中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显抑制作用(P＜0.05);而[3H]胆碱摄取力其值为98±3.1,较之对照组100±2.4,差异不显著,说明MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取力无抑制作用(P＞0.05).另一个有趣的结果是胶质细胞的存在对MPP+的作用有明显影响,未抑制胶质细胞组其作用明显强于抑制胶质细胞组(P＜0.05);同时MPP+使中脑多巴胺能神经元细胞内多巴胺含量明显减少(P＜0.05);TH阳性细胞明显减少(P＜0.05).结论MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显的抑制作用,不仅使多巴胺的摄取降低,而且细胞内的多巴胺含量也显著减少,TH免疫组化染色结果也支持这一结果.MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取能力无明显抑制作用.     

微小RNA-7在帕金森病患者血清中的表达及其临床意义

目的探讨微小RNA-7(miR-7)在帕金森病(PD)患者血清中的表达,并分析其与患者病情严重程度的关系及其对疾病的诊断价值。方法选取2017年1月到2019年10月期间在我院接受治疗的PD患者58例作为PD组,根据Hoehn-Yahr分级进行分组,其中<Ⅲ期的患者纳入到轻度PD组(25例),≥Ⅲ期的患者纳入到重度PD组(33例)。另选取同期在我院体检的健康志愿者30名作为对照组。采用实时荧光定量PCR检测血清miR-7的相对表达量,并采用统一PD评定量表(UPDRS)统计PD患者的UPDRSⅠ评分、UPDRSⅡ评分、UPDRSⅢ评分。采用Pearson进行相关性分析,采用ROC曲线分析血清miR-7对PD的诊断价值。结果 PD组的血清miR-7相对表达量(0.77±0.28)明显低于对照组(1.04±0.36),差异具有统计学意义(P<0.05)。轻度PD组的血清miR-7相对表达量(0.88±0.31)明显高于重度PD组(0.69±0.22),差异具有统计学意义(P<0.05)。Pearson分析显示, PD患者血清miR-7与病程、UPDRSⅠ评分均无明显的相关...     

深部电刺激脑内靶点在帕金森病中的应用

本综述脑深部电剌激(DBS)治疗帕金森病常用靶点的临床应用，目前常用靶点包括丘脑腹中间核(Vim)，苍白球内侧(GHi)和丘脑底核(STN)，根据病人症状可选择不同靶点。Vim DBS对单纯震颤的帕金森病有显疗效，GPi DBS和STN DBS适用于既有震颤和僵硬的帕金森病病人，又适用于运动迟缓和异动症病人，术后可逐渐减少服用多巴胺的剂量。目前认为STN DBS缓解震颤和僵硬疗效要优于GPi和Vim DBS，研究表明STN DBS具有一定的神经保护作用，它抑制了STN的过度兴奋，使谷氨酸的释放减少，降低对投射区域的神经毒性作用，减少了多巴胺能神经元的变性，延缓帕金森病的进展，可作为DBS治疗帕金森病的首选靶点。     

左旋多巴对帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元及纹状体多巴胺递质的影响

目的　研究长期应用左旋多巴对帕金森病 (PD)大鼠黑质多巴胺 (DA)能神经元和DA递质的影响。方法　采用 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)制备部分损毁和严重损毁的PD大鼠模型 ,给两种模型口服不同剂量左旋多巴 /苄丝肼 3个月 ,通过观察大鼠旋转行为、酪氨酸羟化酶 (TH)免疫组化染色和高效液相色谱 电化学检测仪 (HPLC ECD)检测纹状体单胺类递质 ,研究左旋多巴对PD大鼠残存的黑质DA能神经元的影响。结果　 (1)左旋多巴对PD大鼠的旋转行为无明显影响 ;(2 )TH阳性细胞数损毁侧 /非损毁侧比值在左旋多巴喂药组和不喂药对照组的差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ;(3)在严重损毁组 ,大剂量左旋多巴使PD大鼠损毁侧DA和 3,4二羟基苯乙酸 (DOPAC)水平明显升高(P <0 0 1)。结论　长期使用左旋多巴对 6 OHDA单侧损毁的PD大鼠残存的黑质DA能神经元无毒性作用。     

Neurturin基因克隆及其在Vero细胞中的表达

BACKGROUND： Transplantation of cell lines expressing neurturin （NTN） has been used to treat animal models of Parkinson＇s disease. However, gone homology between humans and rats varies greatly, so experimental results are not entirely suitable for understanding cellular transplantation in humans. OBJECTIVE： To explore expression of NTN in African green monkey kidney cells （Vero cells）; to obtain a stably NTN expressing cell line. DESIGN, TIME AND SETTING： An observation study of gone engineering and cellular biology was performed at the Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College between 2005 and 2008. MATERIALS： Human embryonic hepatic tissues, expression vector pcDNA3, and Vero cells were prepared in this laboratory. Primers were synthesized by TaKaRa Biotechnology, Dalian, China; RNA extraction kit and plasmid extraction kit were purchased from Shanghai Watson Bioengineering, China; G418 and MTT were purchased through Sigma, USA; Lipofectamine2000 was a product of Invitrogen, USA; mice anti-human NTN antibody and fluorescent labeling goat anti-mouse IgG antibody were provided by Jingmei Biotech, China. METHODS： Total RNA was harvested from human embryonic hepatic tissues, and NTN cDNA was cloned by RT-PCR method, followed by subcloning into the pcDNA3 eukaryotic expression vector. The obtained pcDNA3/hNTN was stably transfected into Vero cells using Lipofectamine 2000, and stably expressing clones were selected using G418. MAIN OUTCOME MEASURES： NTN mRNA and protein expressions were respectively identified by RT-PCR and immunofluorescence. The morphology of transfected cells was observed under inverted microscopy, and the growth characteristics of those cells were determined using MTT method. RESULTS： A clonal cell line, stably expressing human NTN mRNA and protein, was obtained through stable transfection of pcDNA3/hNTN into Vero cells. The transfected Veto cells exhibited irregular morphology, rather than a spindle shape. The growth retardation phase was prolonged, but the number of cells was identical to non-transfected cells. CONCLUSION： Vero cell lines, which stably expressed human NTN protein, were obtained, and expression patterns of these cell lines were acceptable.     

还原型谷胱甘肽对帕金森病保护性治疗的实验研究

目的观察还原型谷胱甘肽对帕金森病(PD)大鼠模型的保护性治疗作用,并探讨其作用机理.方法应用6-羟基多巴制作PD大鼠模型.将大鼠模型随机分为4组(每组8只):模型组,谷胱甘肽(GSH)组,左旋多巴(Ldopa)组,谷胱甘肽 左旋多巴组,另设对照组(8只),分别给予相应处理,共45天,给药前后均进行行为学测试,给药结束后行免疫组化和电镜观察,并测定黑质区谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)及线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ水平.结果 (1)GSH对其旋转行为无明显影响(P＞0.05);(2)GSH 能减轻黑质区氧化应激损伤;(3)GSH能增强黑质呼吸链酶复合体Ⅰ活性;(4)免疫组化发现GSH组TH-IR神经元较模型组明显增多(P＜0.001);(5)电镜下发现GSH可部分延缓凋亡进程.结论 (1)GSH能减轻黑质区氧化应激损伤,并对线粒体呼吸链具有一定保护作用;(2)GSH与L-dopa合用既可有效改善症状,又对残存黑质多巴胺能神经元具有保护性治疗作用.     

帕金森病与细胞凋亡的新进展

帕金森病的病因和发病机理尚不十分清楚。最近的研究表明细胞凋亡可能在帕金森病的黑质多巴胺能神经元死亡中起重要作用，本综述了近年的研究进展。     

凝血酶诱导的小胶质细胞激活促进多巴胺能神经元变性

目的探讨凝血酶（Thrombin）诱导小胶质细胞（Micoglia）激活与黑质多巴胺能神经元变性的关系。方法采用立体定向术注射凝血酶至大鼠黑质,在不同时间点观察酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）神经元的表达及小胶质细胞的激活情况;同时检测黑质NO量及iNOS mRNA表达。结果（1）凝血酶注入大鼠黑质导致明显的黑质多巴胺能神经元变性,呈时间依赖性,TH阳性细胞数在第3d开始下降,第7d有大量的TH阳性细胞丢失,与对照侧相比下降达约53％（P〈0．01）;高倍镜下可见胞体皱缩、突起明显缩短或减少;14d时细胞数下降至21％,30d时下降至12％（P〈0．01）。（2）凝血酶注射入黑质4h后小胶质细胞开始呈现为“灌木丛样”或少量呈现“阿米巴样”：12h后小胶质细胞数目明显增加且绝大部分呈现“阿米巴样”;24h后细胞已完全激活,“阿米巴样”细胞达高峰;3d维持高峰;14d后小胶质细胞染色变淡,体积变小,“阿米巴样”细胞数目下降。（3）与对照组相比,iNOSmRNA表达明显上调及NO合成增加（P〈0．05）,并且有iNOS在小胶质细胞表达。结论凝血酶对多巴胺能神经元具有一定的损毁作用,小胶质细胞的激活先于多巴胺能神经元变性,其激活后释放的NO有可能参与多巴胺能神经元变性。     

Brain-derived neurotrophic factor and substantia nigra dopaminergic neurons in Parkinson''s disease

BACKGROUND:Parkinson's disease (PD) is a chronic, progressive neurodegenerative central nervous system disease which occurs in the substantia nigra-corpus striatum system. The main pathological feature of PD is selective dopaminergic neuronal loss with distinctive Lewy bodies in populations of surviving dopaminergic neurons. In the clinical and neuropathological diagnosis of PD, brain-derived neurotrophic factor mRNA expression in the substantia nigra pars compacta is reduced by 70%, and surviving dopaminergic neurons in the PD substantia nigra pars compacta express less brain-derived neurotrophic factor (BDNF) mRNA (20%) than their normal counterparts. In recent years, knowledge surrounding the relationship between neurotrophic factors and PD has increased, and detailed pathogenesis of the role of neurotrophic factors in PD becomes more important.     

Effect of rifampicin pre- and post-treatment on rotenone-induced dopaminergic neuronal apoptosis and alpha-synuclein expression

BACKGROUND: Rifampicin inhibits the formation of α-synuclein multimer and protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyritine (MPTP)-induced PC12 cell apoptosis.OBJECTIVE: To compare the effect of rifampicin pre-and post-treatment on tyrosine hydroxylase and α-synuclein expression in substantia nigra pars compacta in a rat model of Parkinson’s disease.DESIGN,TIME AND SETTING: A randomized,controlled experiment was performed at the Experimental Animal Center of Sun Yat-sen University North Campus (...     

Lack of alpha-synuclein does not alter apoptosis of neonatal catecholaminergic neurons

alpha-Synuclein is an abundant neuronal protein of uncertain function linked to Parkinson's disease. Numerous studies have proposed an antiapoptotic function for alpha-synuclein, based on overexpression experiments in cell lines. To explore whether alpha-synuclein has such a physiological function, we assessed the response of wild type or alpha-synuclein null neonatal mouse sympathetic neurons to nerve growth factor deprivation, a well-characterized stimulus of neuronal apoptosis. There was no difference in the rate of neuronal loss, neuronal apoptosis, or c-jun phosphorylation. Furthermore, the absence of alpha-synuclein did not alter the magnitude of naturally occurring cell death in vivo in substantia nigra pars compacta. Therefore, alpha-synuclein is unlikely to play a significant role in apoptotic signalling in catecholaminergic neurons of the neonatal nervous system.     

提高帕金森病动物模型制作成功率的方法学探讨及模型综合评价

目的探讨提高6-OHDA帕金森病(PD)大鼠模型制作成功率的方法,并对模型进行综合评价。方法取SD大鼠90只,将6-OHDA立体定向注射于左侧黑质区及中脑腹侧被盖,观察大鼠的行为、黑质抗氧化指标、线粒体呼吸链及黑质细胞形态学的变化。结果①经阿朴吗啡诱导后共筛选出成功模型64只,成功率为71%;②模型大鼠黑质区ROS、MDA水平均明显升高,而GSH-Px活性则明显降低;③模型大鼠黑质区存在线粒体呼吸链功能障碍;④免疫组化发现注射侧黑质区多巴胺能神经元较对侧明显减少(P<0.001);⑤电镜观察发现模型大鼠黑质细胞同时存在凋亡、变性和坏死样改变。结论应用本方法可较快建立稳定的成功率较高的PD大鼠模型,该方法是通过增强氧化应激、干扰线粒体呼吸链功能、诱导凋亡甚至引发坏死等不同机制损毁多巴胺能神经元的,同PD的发病机制基本一致。