帕金森病IgG诱导多巴胺能神经元损伤机制的初步研究

目的采用帕金森病(PD)患者的血清IgG建立PD的细胞模型,探讨其诱导中脑多巴胺(DA)能神经元损伤的机制.方法采用四唑盐(MTF)检测、免疫细胞化学染色和液闪测定法评价DA能细胞数目、形态和功能的变化,并检测一些毒性物质的作用,肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)用酶联免疫吸附试验(ELISA法);NO用Griess法;O-2用细胞色素C还原法.结果PD IgG在补体参与时,可诱导原代中脑神经元-胶质细胞培养体系的DA能神经元出现选择性损伤(DA摄取力由1012.3 cpm下降至670.5 cpm,P＜0.01).疾病对照组和健康对照组的IgG即使在补体存在时对DA能细胞的数目、形态和功能也无明显影响(P＞0.05).原代培养如抑制胶质细胞,则PD IgG即使在补体存在时对DA能细胞也无明显的毒性作用(P＞0.05).来源于毒性物质的检测、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)、抗TNF-α、抗IL-Iβ、L-硝基-精氨酸甲酯的数据表明,PD IgG诱导的DA能神经元的损伤受O-2(4.65 nmoL/106细胞)的介导.结论PD IgG可诱导原代培养的中脑DA能神经元的选择性损伤,受补体、胶质细胞和活性氧自由基的介导,提示PD的发病可能涉及免疫机制.     

左旋多巴和多巴胺对中脑原代细胞的毒性作用

目的:观察左旋多巴和DA对中脑原代培养细胞的毒性作用.方法:采用大鼠胚胎中脑原代细胞培养法,运用TH免疫荧光染色和[3H]DA摄取率检测DA能神经元的存活数和功能;GFAP免疫荧光染色检测星形胶质细胞的存活数;以及MTT检测非DA能神经元的存活数.结果:左旋多巴或DA处理后的TH阳性和GFAP阳性细胞数以及细胞存活率均显著低于加药前基数,且呈剂量依赖性;同时残存细胞体积变小,突起减少、变短或断裂.TH阳性细胞和GFAP阳性细胞比非DA能神经元更易受损.结论:左旋多巴和DA对中脑原代细胞培养中的DA能神经元和非DA能神经元均有毒性作用.     

左旋多巴和多巴胺对中脑原代细胞的毒性作用

目的：观察左旋多巴和DA对中脑原代培养细胞的毒性作用。方法：采用大鼠胚胎中脑原代细胞培养法，运用TH免疫荧光染色和[^3H]DA摄取率检测DA能神经元的存活数和功能；GFAP免疫荧光染色检测星形胶质细胞的存活数；以及MTT检测非DA能神经元的存活数。结果：左旋多巴或DA处理后的TH阳性和GFAP阳性细胞数以及细胞存活率均显著低于加药前基数，且呈剂量依赖性；同时残存细胞体积变小，突起减少，变短或断裂。TH阳性细胞和GFAP阳性细胞比非DA能神经元更易受损。结论：左旋多巴和DA对中脑原代细胞培养中的DA能神经元和非DA能神经元均有毒性作用。     

青藤碱防护脂多糖所致PD大鼠黑质多巴胺能神经元损伤实验研究

目的观察中药青藤碱(SN)对脂多糖(LPS)所致大鼠黑质多巴胺能(DA)神经元损伤的保护作用。方法黑质内注射LPS制作PD大鼠模型。应用SN对实验动物进行预处理。实验分为对照组、PD组及SN组,采用行为学、酪氨酸羟化酶(TH)、环氧化酶-2(COX-2)等免疫组化及免疫印迹技术等观察SN对LPS所致黑质DA能神经元损伤的保护作用。结果对照组大鼠无任何行为变化,PD组大鼠平均旋转圈数为196.90±9.52,SN组明显减少,为98.79±8.81,差异非常显著(P<0.01)。TH免疫组化表明对照组黑质TH阳性神经元数量较多,胞体较大,突起明显;PD组TH阳性神经元数量明显减少,甚至消失,神经元胞体萎缩,突起亦不清晰,差异非常显著(P<0.01)。SN组TH阳性神经元数量与PD组相比明显增加(P<0.01),神经元形态变化亦不明显。COX-2免疫组化表明对照组黑质致密部偶见COX-2阳性细胞,PD组可见大量散在分布的COX-2阳性细胞,SN组COX-2阳性细胞数与PD组相比明显减少,差异非常显著(P<0.01)。小胶质细胞特异性抗体(OX-42)免疫组化表明对照组大鼠黑质小胶质细胞多呈静止的分枝样状态,PD组多...     

阿尔茨海默病患者表现帕金森病样临床特征的机制

目的 探讨阿尔茨海默病(AD)患者表现帕金森病(PD)样临床特征的机制.方法 用0.5、1.0和2.0μmol/L β-淀粉样蛋白(Aβ)1-42处理Fischer 344大鼠、小胶质细胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(亦称吞噬细胞氧化酶,PHOX)野生型(PHOX / )及其基因敲除(PHOX-/-)小鼠的中脑神经元-胶质细胞、神经元-星形胶质细胞和小胶质细胞培养体系:(1)检测多巴胺(DA)能神经元摄取能力;(2)计数酪氮酸羟化酶阳性(TH )DA能神经元数并观察细胞形态;(3)对小胶质细胞进行补体受体-3抗体(OX-42)染色并观察细胞形态;(4)检测小胶质细胞中超氧化物(O2)和细胞内活性氧类物质(iROS)水平.结果 (1)在大鼠神经元-胶质细胞中,0.5、1.0和2.0μmol/L Aβ组DA能神经元摄取能力分别为对照组的72%、61%和54%,TH 神经元数分别为对照组的77%、64%和52%,与对照组比较差异均具统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);DA能神经元胞体皱缩,胞浆淡染,神经突起数目减少、变短、变细,严重时中断甚至消失.(2)在大鼠神经元-星形胶质细胞中,0.5、1.0和2.0 Fmol/L Aβ组DA能神经元摄取能力分别为对照组的94%、96%和92%,与神经元一胶质细胞的结果比较差异均具统计学意义(均P＜0.01);小胶质细胞体积明显增大,胞浆深染,形状不规则;小胶质细胞产生的O2分别为对照组的194%、250%和300%,iROS分别为44、65和84荧光单位,与对照组比较差异均具统计学意义(均P＜0.01);(3)在PHOX / 和PHOX-/-小鼠,0.5、1.0和2.0 μmol/L Aβ组DA能神经元摄取能力分别为对照组的69%、64%、51%和91%、86%、80%,前组明显低于后组(P＜0.05,P＜0.01);产生的O2 分别为对照组的167%、250%、317%和88%、49%、61%,产生的iROS分别为14、38、164和0、12、80荧光单位,前组均明显高于后组(P＜0.05,P＜0.01);PHOX / 小鼠DA能神经元胞体及突起的损伤明显重于PHOX-/-小鼠.结论 Aβ通过PHOX从功能及形态上激活小胶质细胞,损伤DA能神经元,可能是AD患者出现PD样临床特征的机制,这为抑制小胶质细胞的PHOX成为治疗神经变性疾病的新靶点提供了一定依据.     

左旋多巴对帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元及纹状体多巴胺递质的影响

目的　研究长期应用左旋多巴对帕金森病 (PD)大鼠黑质多巴胺 (DA)能神经元和DA递质的影响。方法　采用 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)制备部分损毁和严重损毁的PD大鼠模型 ,给两种模型口服不同剂量左旋多巴 /苄丝肼 3个月 ,通过观察大鼠旋转行为、酪氨酸羟化酶 (TH)免疫组化染色和高效液相色谱 电化学检测仪 (HPLC ECD)检测纹状体单胺类递质 ,研究左旋多巴对PD大鼠残存的黑质DA能神经元的影响。结果　 (1)左旋多巴对PD大鼠的旋转行为无明显影响 ;(2 )TH阳性细胞数损毁侧 /非损毁侧比值在左旋多巴喂药组和不喂药对照组的差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ;(3)在严重损毁组 ,大剂量左旋多巴使PD大鼠损毁侧DA和 3,4二羟基苯乙酸 (DOPAC)水平明显升高(P <0 0 1)。结论　长期使用左旋多巴对 6 OHDA单侧损毁的PD大鼠残存的黑质DA能神经元无毒性作用。     

周围神经细胞悬液对体外培养的骨髓基质干细胞诱导分化的影响

目的应用周围神经细胞悬液、中脑条件培养基与细胞因子联合诱导骨髓基质干细胞(MSCs)转化为多巴胺(DA)能神经元。探索体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件。方法取雄性SD大鼠股骨和胫骨骨髓,进行MSCs的体外培养和传代扩增。碱性成纤维细胞生长因子预诱导后,依据处理因素不同分为对照组及实验组(周围神经细胞悬液组、周围神经细胞悬液 中脑条件培养基组)。倒置显微镜下观察细胞形态变化,在诱导第7天进行神经元特异烯醇化酶(NSE),酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。结果对照组及实验各组7d NSE阳性细胞数分别为2.304±0.767,37.411±2.89.37.836±2.836(细胞数/每视野)。各组以周围神经细胞悬液 中脑条件培养基组NSE阳性细胞率最高,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组及实验各组7d TH阳性细胞数分别为0,10.44±0.511,16.671±0.544(细胞数/每视野)。以周围神经细胞悬液 中脑条件培养基组TH阳性细胞数量较多,差异非常显著(P<0.01)。结论周围神经细胞悬液、中脑条件培养基与细胞因子联合可明显促进MSCs向神经元样细胞分化,并促进细胞表达TH。     

凝血酶诱导小胶质细胞激活与黑质多巴胺能神经元变性关系的研究

目的探讨凝血酶诱导小胶质细胞激活与黑质多巴胺（DA）能神经元变性的关系。方法采用脑立体定向术将凝血酶注射人大鼠黑质，采用尼氏（Nissl）染色、酪氨酸羟化酶（TH）及特异性小胶质细胞表面补体受体（CR3）单克隆抗体（OX-42）标记免疫组织化学染色，观察凝血酶注射人大鼠黑质后不同时间点TH阳性多巴胺能神经元数量及小胶质细胞的激活情况。结果凝血酶注入黑质4h后小胶质细胞开始呈现“灌木丛样”或少量呈现阿米巴样；12h小胶质细胞数目明显增加且绝大部分呈现阿米巴样；24h已完全激活，“阿米巴样”细胞达高峰；3d维持高峰；14d后小胶质细胞染色变淡，体积变小，阿米巴样细胞数目下降。TH阳性细胞数在第3d开始下降，第7d有大量的TH阳性细胞丢失，与对照侧相比下降达约53％（P〈0．01），高倍镜下可见胞体皱缩、突起明显缩短或减少，14d时细胞数下降至21％，30d时约为12％（P〈0．01）。结论凝血酶对DA能神经元具有一定的损毁作用，小胶质细胞的激活先于DA能神经元变性，其活化可能参与DA能神经元变性。     

铁选择性损伤多巴胺能神经元的神经免疫炎症机制

目的 在模拟人中脑黑质的多种原代细胞培养体系中,研究铁对多巴胺能神经元的损伤及其神经免疫炎症机制.方法 采用5、25和100μmol/L的Fecl2(Fe2+):(1)处理中脑原代神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞混合培养体系,7 d后计数酪氨酸羟化酶(TH)(+)多巴胺能神经元及抗神经特异性核蛋白抗体(Neu-N)(+)的全部神经元的数量,观察神经元形态,研究Fe2+对多巴胺能神经元的选择性损伤;(2)同时处理中脑原代神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞混合培养体系和神经元-星形胶质细胞培养体系,7 d后计数TH(+)多巴胺能神经元的数量,研究小胶质细胞在Fe2+选择性损伤多巴胺能神经元中的作用;(3)处理原代小胶质细胞培养体系,测量细胞外超氧化物(O2·-)及细胞内活性氧类物质(iROS),研究Fe2+激活小胶质细胞导致的功能变化;(4)处理中脑原代神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞混合培养体系,7 d后计数抗补体受体-3(OX-42)(+)小胶质细胞的数量,观察细胞形态,研究Fe2+激活小胶质细胞导致的形态学变化.结果 (1)5、25和100μmol/L Fe2+处理组TH(+)多巴胺能神经元的数量分别为对照组的89%、70%和55%,其中25、100 μmol/L Fe2+处理组与对照组比较差异具有统计学意义(F=12.047,P＜0.01);多巴胺能神经元胞体皱缩,胞质淡染,神经突起数目减少;(2)5、25和100 μmol/L Fe2+处理组Neu-N(+)全部神经元的数量分别为对照组的100%、104%和101%,与对照组比较差异均无统计学意义;5、25和100μmol/L Fe2+处理组Neu-N(+)全部神经元的数量与TH(+)多巴胺能神经元数量的差值分别为11%、34%和46%,其中25和100 μmol/L Fe2+处理组两种神经元数量的差异具有统计学意义(分别为t=8.098,P＜0.05;t=11.218,P＜0.05);(3)在中脑原代神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞混合培养体系和神经元-星形胶质细胞培养体系中,25μmoL/L Fe2+处理组TH(+)多巴胺能神经元的数量分别为对照组的70%和98%,差值为28%,差异具有统计学意义(t=8.061,P＜0.05);100 μmoL/LFe2+处理组TH(+)多巴胺能神经元的数量分别为对照组的55%和75%,差值为20%,差异具有统计学意义(t=9.025,P＜0.05);(4)5、25和100μmoL/L Fe2+处理组产生的细胞外O2·-分别为对照组的100%、127%和163%,其中100 μmol/L Fe2+处理组与对照组比较差异具有统计学意义(t=9.015,P＜0.005);5、25和100μmol/L Fe2+处理组产生的iROS分别为对照组的147%、172%和231%,其中25和100μmol/L Fe2+处理组与对照组比较差异具有统计学意义(F=3.091,P＜0.05);(5)5、25和100 μmol/L Fe2+处理组OX-42(+)小胶质细胞数量分别为对照组的183%、190%和240%,其中25和100μmol/L Fe2+处理组与对照组比较差异具有统计学意义(F=6.101,P＜0.01);小胶质细胞激活后胞体变大,形状不规则.结论 Fe2+激活小胶质细胞,使其形态发生显著变化,并产生大量神经毒性因子,选择性损伤多巴胺能神经元;为抑制铁过度激活小胶质细胞成为治疗PD的新策略提供依据.

Abstract：

Objective To investigate the role and neuroinflammatory mechanism of iron on dopamine ( DA) neurons in multiple primary midbrain cultures that mimic human substantia nigra pars compacta.Methods Ferrous chloride ( Fe2+ ) with the desired concentrations of 5,25 and 100 μmol/L was used to ( 1 ) treat primary midbrain neuron-microglia-astroglia cultures for 7 days and the numbers of DA neurons and total neurons were counted after tyrosine hydroxylase (TH) and neuron-specific neuclear protein neurons in 5,25 and 100 μmol/L Fe2 + -treated groups were 89%,70% and 55% of control group,and 25,100 μmol/L Fe2+ significantly decreased DA neuronal numbers compared with control group ( F = 12.047,P ＜0.01);DA neuronal bodies were shrunk and smaller,cytoplasmic stainings were reduced,neuronal dendrites were decreased;(2) The numbers of Neu-N ( + ) total neurons in 5,25 and 100 μmol/L Fe2+-treated groups were 100%,104% and 101% of control group and Fe2+ did not decrease DA neuronal numbers compared with control group (t =4.458,P ＞ 0.05 );5,25 and 100 μmol/L Fe2+-induced difference between total neurons and DA neurons were 11%,34% and 46%,and 25 and 100 (Amol/L Fe2+ produced significant difference(t =8.098,P ＜0.05;t = 11.218,P＜0.05);(3) In primary midbrain neuron-microglia-astroglia and neuron-astroglia cultures,the numbers of DA neurons in 25 μmol/L Fe+-treated group were 70% and 98% of control group,respectively.The difference between two groups was 28%,which was statistically significant (t =8.061,P＜0.05);The numbers of DA neurons in 100 μmol/L groups were 183%,190 % and 240% of control group,and 25 and 100 μmol/L Fe2 + significantly increased microglial numbers compared with control group ( F = 6.101,P ＜ 0.01 );dramatic changes of microglial morphology were indicated by the enlarged cell bodies and irregular shape.Conclusions Fe2 + provokes selective DA neuronal damage and microglia are the mediators of the neurotoxic effect,which may be due to microglial over-activation featured by the significant production of neurotoxic factors and morphological changes of microglia.This investigation cast a new light for PD therapy by inhibiting Fe2+ -induced neuroinflammation characterized by the microglial over-activation.     

PD模型中GDNF与星形胶质细胞对黑质DA能神经元的影响

目的探讨星形胶质细胞和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)在帕金森病(Parkinson's disease,PD)中对多巴胺(dopamine neurons,DA)能神经元损伤的影响。方法成年大鼠右侧前脑侧束注射6羟多巴胺(6-OHDA)制备PD模型。PD模型右侧黑质内注射GDNF,于注射后第6周采用免疫组织化学方法观察星形胶质细胞神经纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylasa,TH)的变化。结果模型组、PBS和GDNF组注射侧与非注射侧星形胶质细胞相比,均发现GFAP阳性细胞明显增多,DA能神经元数量明显减少(P<0.05)。GDNF组与模型组相比,发现GFAP阳性细胞明显增多,同时残存的DA能神经元数量有所增加(P<0.05)。结论黑质内注射GDNF可能通过激活的星形胶质细胞保护PD大鼠模型黑质DA能神经元。