蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元变性伴包涵体形成

目的 观察蛋白酶体抑制剂诱导黑质多巴胺(DA)能神经元变性伴胞浆内包涵体形成，探讨蛋白酶体功能在帕金森病发病机制中的作用。方法将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射至大鼠黑质部位。免疫荧光观察黑质区DA神经元变性缺失及胶质细胞变化。免疫荧光双标法观察DA能神经元内蛋白聚集的包涵体及其主要成分α-共核蛋白(α-synuclein)、Parkin和泛素(ubiquitin)的表达。同时观察。DA能神经元发生细胞凋亡。结果注射Lactacystin第7天大鼠开始出现自发性活动减少，阿扑吗啡可诱导出旋转行为；3周后黑质部位酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞减少，呈剂量依赖性；小胶质细胞增生明显。TH与硫磺素、硫磺素与α-synuclein、硫磺素与Parkin、以及硫磺素与ubiquitin复合染色呈阳性；TH与TUNEL双染亦呈阳性。结论Lactacystin对多巴胺能神经元具有毒性作用，且导致蛋白聚集，包涵体形成。蛋白酶体功能异常可能在帕金森发病机制中起重要作用。     

蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元变性及诱导型一氧化氮合酶变化

目的探讨蛋白酶体（proteasome）功能下降在帕金森病（PD）发病机制中的作用，以及模型大鼠脑内黑质部位诱导型一氧化氮合酶（iNOS）是否参与蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导的多巴胺能神经元变性。方法将30只健康雄性SD大鼠分为5组（生理盐水对照组，1d组、3d组、1周组、3周组），每组6只。将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射至大鼠黑质部位，记录大鼠在不同时间点的行为学改变，并用免疫组化方法观察生理盐水对照组及不同时间点组（1d、3d，1周、3周）大鼠黑质区多巴胺能神经元变性及iNOS变化。结果Lactacystin注射1周后大鼠开始出现自发性活动减少，阿朴吗啡可诱导出旋转行为；3周后，30min旋转次数为258．90±11．56；实验3周组黑质部位TH阳性细胞减少。1d后iNOS阳性细胞明显增多，3d时达高峰，1周后开始下降，3周时基本消失。结论蛋白酶体功能下降可能是多巴胺能神经元变性的始动因素，而iNOS上调可能是多巴胺能神经元变性的重要过程。     

百草枯诱导小鼠α-突触核蛋白表达升高并聚集的实验研究

目的观察除草剂百草枯诱导小鼠黑质细胞α-突触核蛋白(α—synuclein，α-syn)表达及聚集，探讨环境因素在帕金森病(Parkinsondisease，PD)发病中的作用机制。方法C57BL小鼠按体重10mg／kg经腹腔注射百草枯，应用原位杂交、RT—PCR分析α—syn mRNA表达．免疫组化、免疫荧光双标染色观察黑质区α—syn显色．并进一步确定表达rsyn的神经元表型及α—syn聚集。结果注射百草枯组小鼠黑质区α—syn mRNA表达量升高，rsyn阳性细胞数相对增加；rsyn与硫磺素、酩氨酸羟化酶(tyroxine hydroxylase，TH)及硫磺素复合染色的阳性细胞数均升高。结论百草枯诱导小鼠黑质细胞α—syn表达升高并出现蛋白聚集可能是导致PD发病的机制之一。     

蛋白酶体抑制剂诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成

目的 观察蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成及运动行为学的改变,探讨蛋白酶体功能下降在帕金森病(PDl发病机制中的作用. 方法 24只SD大鼠采用随机数字表法分为kactacystin实验组和生理盐水组.每组12只,Lactacystin实验组将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射人大鼠左侧黑质致密部(SNc).生理盐水组注射等体积生理盐水;观察大鼠自主行为和阿朴吗啡(APO)诱导的旋转行为的改变;Nissl染色法观察SNc病理改变;免疫组化法观察SNc及纹状体酪氨酸羟化酶(TH)和SNc中α-共核蛋白的表达;透射电镜观察SNc超微结构的改变. 结果 Lactacystin实验组大鼠给药7 d后出现自发性活动减少、动作缓慢、震颤、且症状逐步加重.APO可诱导出向健侧的旋转运动;Nissl染色发现Lactacystin实验组左侧SNc神经元数量减少,尼氏体结构松散;免疫组化结果表明21 d后Lactacystin实验组左侧SNc出现变性,TH免疫阳性神经元数量减少,α-共核蛋白表达增强,纹状体内TH免疫阳性纤维数量减少;电镜观察到蛋白质聚集形成的包涵体. 结论 Lactacystin单侧SNc注射可以诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成及大鼠行为改变.蛋白酶体功能下降可能在PD发病机制中起重要作用.     

应用蛋白酶体抑制剂Lactacystin建立有Lewy体的帕金森病大鼠模型

目的建立符合帕金森病(PD)病理特征———黑质细胞有Lewy体的PD大鼠模型。方法分别在大鼠一侧黑质致密部注射蛋白酶体抑制剂Lactacystin8mg(Lactacystin组)、等体积生理盐水(NS组)和6-羟基多巴胺(6-OHDA组)12mg;观察大鼠自主行为和阿朴吗啡诱导的旋转行为;光镜下观察中脑组织学改变;应用免疫组化染色观察黑质细胞α-synuclein表达和酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数;测定纹状体区多巴胺和高香草酸含量。结果NS组大鼠未见行为异常;Lactacystin组大鼠出现进行性的运动迟缓、少动、震颤、头向健侧倾斜,注射阿朴吗啡后出现向健侧旋转运动;给药后3周黑质部TH阳性细胞数较NS组减少了83.29%(P<0.01),部分黑质细胞内出现α-synuclein免疫反应呈强阳性的Lewy体;纹状体多巴胺和高香草酸含量(154.82±37.17,98.66±18.81)较NS组明显减少(822.87±131.25,617.77±95.74)(均P<0.01);6-OHDA组大鼠出现与Lactacystin组类似的行为变化,黑质细胞亦显著减少,但未见Lewy体。结论利用蛋白酶体抑制剂Lactacystin阻碍α-synuclein的降解可以建立有Lewy体的PD大鼠模型。     

Lactacystin诱导的帕金森病大鼠模型病理退行性改变的研究

目的 观察Lactacystin诱导的帕金森病(PD)模型大鼠的病理退行性改变,探索其发病机制.方法 取成年健康SD大鼠32只,采用随机数字表法分为实验组(16只)和对照组(16只),实验组左侧黑质致密部(SNc)注射蛋白酶体抑制剂Lactacystin,对照组以等体积生理盐水代替.分别存注射后1、3、5、7、9、11、14和21 d,观察两组大鼠的行为学变化;应用HE染色观察小胶质细胞并计数,免疫组化检测黑质及纹状体组织罗暗算酪氨酸羟化酶(TH)神经元变化和RT-PCR检测黑质部TH和α-synuclein mRNA的表达.结果 与对照组相比,实验组大鼠逐渐出现行为学改变:HE染色显示小胶质细胞在注射Lactacystin后第1天为(3501.92±57.32)个,第7天为(4895.50±52.67)个,第21天为(5340.18±52.87)个,与对照组(3271.23±63.76)个相比增高,差异具有统计学意义(P＜0.05):免疫组化检测显示黑质中多巴胺(DA)神经元在注射Lactacystin后逐渐变性死亡,第7天神经元数为(568.57±36.39)个,第21天为(119.67±21.06)个,与对照组(679.76±30.24)个相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);免疫组化检测纹状体TH免疫阳性纤维显示其在注射Lactacystin后逐渐稀疏,强度逐渐变弱,实验组TH免疫阳性纤维平均光密度第7天为(0.1953±0.0076),与对照组(0.2412±0.0067)相比,差异无统计学意义(P＞0.05),第21天为(0.0781±0.0013)个,与对照组(0.2412±0.0067)个相比降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).同时,实验组mRNA检测显示,THmRNA表达越来越少,而α-synuclein mRNA在残存TH神经元中逐渐增多.结论 Lactacystin诱导的PD模型大鼠的病理呈退行性改变.符合PD发病的隐匿性、缓慢进展性特征.     

帕金森病模型鼠黑质α-突触核蛋白表达升高并集聚

目的观察低剂量1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)对小鼠黑质多巴胺能神经元α-突触核蛋白表达的影响。方法C57BL小鼠腹腔注射MPTP20mg/kg体重,每周注射1次连续3周,观察小鼠行为改变,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法、免疫组化染色检测α-突触核蛋白表达,荧光双标染色观察多巴胺能神经元内α-突触核蛋白聚集。结果与注射生理盐水组相比,注射MPTP组小鼠出现暂时性躯干震颤、竖毛、动作减少等;α-突触核蛋白基因表达百分比(79·5%±0·8%,生理盐水组为19·2%±3·3%,P<0·05)及蛋白表达百分比(82·2%±4·1%,生理盐水组为18·5%±1·0%,P<0·05)均明显增加;黑质部酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数减少,α-突触核蛋白阳性细胞数增加;α-突触核蛋白与硫磺素S、TH与硫磺素S复合定位染色的阳性细胞数均升高。结论低剂量MPTP可诱导小鼠行为改变,黑质多巴胺能神经元α-突触核蛋白表达升高,并出现蛋白聚集。     

蛋白酶体抑制剂诱导大鼠运动行为改变的研究

目的 观察蛋白酶体抑制剂诱导大鼠黑质变性及大鼠运动行为改变,探讨蛋白酶体功能下降在帕金森病发病机制中的作用.方法 将蛋白酶体抑制剂立体定向注射入大鼠左侧黑质致密部,对照组注射等体积的生理盐水.观察大鼠自主行为和阿朴吗啡诱导的旋转行为的改变.开野实验观察大鼠自发运动行为改变.免疫组织化学法观察黑质致密部及纹状体内酪氨酸羟化酶的表达.结果 Lactacystin组大鼠给药一周后出现自发性活动减少,动作缓慢,震颤、对外界刺激不自主竖毛,且症状逐步加重;阿朴吗啡可诱导出向健侧的旋转运动.开野实验中,Lactacystin组大鼠自发运动行为出现改变.三周后黑质部位酪氨酸羟化酶免疫阳性细胞及纹状体内酪氨酸羟化酶免疫阳性神经纤维减少.结论 蛋白酶体抑制剂Lactacystin单侧黑质致密部微量注射可以诱导大鼠黑质变性并出现运动行为改变,蛋白酶体抑制剂在帕金森病动物模型制备上有潜在价值,蛋白酶体功能下降可能在帕金森病发病机制中起重要作用.     

蛋白酶体抑制剂诱导帕金森病大鼠模型行为学退行性改变的研究

目的观察蛋白酶体抑制剂诱导的帕金森病(PD)行为学退行性变化,探索其发病机制。方法将32只大鼠随机分成实验组和对照组,每组16只,将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射到实验组大鼠左侧黑质致密部,对照组注射等体积生理盐水。术后1、3、5、7、9、11、14、18和21d,追踪观察大鼠自主行为和阿扑吗啡诱导的旋转行为变化;开野实验观察大鼠自发运动行为改变。结果实验组给药后,随着时间推移大鼠开始出现渐进性自发性活动减少、动作缓慢、对外界刺激不自主竖毛、震颤;阿扑吗啡诱导的向健侧旋转运动逐渐增多。开野实验结果显示:实验组大鼠自发运动行为出现渐进性异常改变。结论蛋白酶体抑制剂Lactacystin单侧黑质致密部微量注射诱导的大鼠行为学呈渐进性发展,符合PD发病过程,说明蛋白酶体功能下降可能在PD发病机制起重要作用。     

人羊膜上皮细胞移植治疗帕金森病模型大鼠的疗效评价

目的观察原位移植人羊膜上皮细胞(Human amniotic epithelial cells,hAECs)对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型大鼠的疗效及其在体内的存活与分化。方法方法采用胰蛋白酶消化法分离hAECs,流式细胞术分析表型。30只雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组和hAECs原位移植组。单侧前脑内侧束(Medial forebrain bundle,MFB)注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)建立PD大鼠模型。通过MFB原位移植3×105个hAECs。每周腹腔注射阿朴吗啡诱导旋转观察大鼠的行为变化,免疫荧光染色法检测人细胞核抗原及神经元微管结合蛋白(microtubule-associated protein 2,MAP-2)的表达,免疫组化染色检测酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)的表达。结果与模型组比较,hAECs原位移植组大鼠旋转次数均明显减少(均P<0.05),行为学改善可至少持续至移植后10 w;免疫荧光染色结果显示,hAECs在原位移植区可存活至少12 w,并表达MAP-2;免疫组化染色显示,原位移植hAECs可上调PD模型大鼠黑质TH表达。结论 hAECs原位移植能改善PD模型大鼠的运动行为,其机制可能与上调黑质TH表达有关。hAECs可在原位移植区分化为多巴胺能神经元样细胞。