胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化获取关节软骨细胞*

背景：近年来，众多研究欲采用体外分离培养的关节软骨细胞作为修复缺损的关节软骨的种子细胞，然而，获得纯化的具有生物活性的关节软骨细胞较为困难。 目的：拟运用胰蛋白酶与Ⅱ型胶原酶联合消化获取关节软骨细胞。 方法：从SD大鼠的正常股骨及胫骨关节表面获取关节软骨，先后运用0.25%的胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化，显微镜下见大量细胞游离后，弃去大块的未消化的关节软骨碎片，离心，去上清，PBS洗涤2次后，加入软骨细胞原代培养液进行培养、增殖。应用甲苯胺蓝及苏木精-伊红染色方法检验所得细胞是否为关节软骨细胞。 结果与结论：在严格掌握酶的浓度及消化时间的前提下，通过0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合酶解关节软骨的方法，成功从大鼠股骨及胫骨关节软骨内分离培养出细胞，并经过甲苯胺蓝染色及苏木精-伊红染色证实，所得的细胞为具有生物活性的关节软骨细胞。 关键词：关节软骨细胞；Ⅱ型胶原酶；胰蛋白酶；联合消化；甲苯胺蓝；苏木精-伊红染色     

原代培养小鼠关节软骨细胞的分化与诱导

背景：传统培养方法体外培养的软骨细胞经长时间传代培养后往往去分化为成纤维细胞,导致细胞数量及活性下降。如何避免培养过程中的去分化问题,是模拟体内软骨内成骨软骨发育过程的关键。 目的：课题创新性提出以Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶结合消化法体外培养扩增C57BL/6小鼠关节软骨细胞并诱导其向更成熟肥大软骨细胞或终末分化软骨细胞分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察实验,于2008-09/12在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。 材料：C57BL/6品系新生小鼠9只。 方法：采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化法分离培养C57BL/6 新生小鼠关节软骨细胞,细胞计数法绘制细胞生长曲线,RT-PCR检测Ⅱ型胶原进行鉴定。当细胞90%融合时以含5.5 mg/L人转铁蛋白,3×10-8 mol/L亚硒酸钠,10 mg/L牛胰岛素的ITS诱导培养基进行分化诱导。 主要观察指标：诱导0,7 d,阿利新蓝染色检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖,von Kossa染色检测软骨细胞钙化结节形成情况,实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、X 型胶原及基质金属蛋白酶13的表达进行鉴定。 结果：原代培养细胞24 h贴壁,呈三角或多角形,培养4~6 d进入快速增殖期,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原的表达,证实获得大量高纯度、高活性的软骨细胞。诱导0 d,细胞单层铺满培养皿底面,无聚集现象;诱导7 d 明显可见由软骨细胞聚集形成的软骨小结。与诱导0 d时相比,诱导7 d阿利新蓝染色示软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖染色呈阳性,可见明显的软骨小结,Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13表达明显增高,且钙化结节明显增多。 结论：采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化法获得大量高纯度、高活性的软骨细胞。ITS诱导体系有效地促进了软骨细胞成熟及终末分化,较成功模拟了软骨内成骨的软骨发育过程。     

骨关节炎软骨细胞的体外分离培养

背景：由于体外分离培养骨关节炎患者软骨细胞存在难度，同时软骨组织中因富含大量的基质, 且软骨细胞分布于其中的软骨陷窝中, 因此与其他细胞相比, 软骨细胞的分离更为困难。 目的：从骨关节炎行人工膝关节置换者的关节软骨中分离软骨细胞，并改良其酶消化法分离软骨组织，观察软骨细胞的生物学特性。 设计、时间及地点：对比观察，实验于2007-04/2008-03在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室完成。 对象：标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织（> 3 cm）。 方法：切取原发性骨关节炎患者关节软骨，将软骨剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的碎块，以Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶消化分离关节软骨细胞,同期对比用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶消化法消化软骨后的收获细胞数及细胞成活率，分离细胞进行原代和传代培养。 主要观察指标：以倒置相差显微镜观察体外培养软骨细胞形态；以甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行软骨细胞鉴定；四甲基偶氮唑盐法测定骨关节炎细胞增殖情况。 结果：改良的Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶法，对原代关节软骨细胞的分离取得了优良而稳定的效果，与传统的胰蛋白酶消化法相比，收获细胞数为3.72×106，细胞存活率为97.5%，二者相比有显著性差异（P < 0.05）。体外培养观察软骨细胞贴壁和生长均较缓慢。原代和传代后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝异染反应均较弱。软骨细胞增殖和生长缓慢。 结论：Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶分离骨关节炎患者软骨细胞的技术简单且易操作, 分离培养的软骨细胞符合骨关节炎时软骨退变的表现, 可为骨关节炎的病因研究及软骨细胞移植治疗骨性关节炎提供实验基础。     

关节软骨损伤后体外培养软骨细胞的功能变化

背景：关节软骨损伤可以影响软骨细胞功能,诱发创伤性骨关节炎。 目的：观察关节软骨损伤后体外培养的软骨细胞功能的变化。 方法：通过酶消化法分离培养高能量、低能量撞击后和正常兔膝关节透明软骨细胞,观察创伤能量对软骨细胞生存能力的影响;检测软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力,检测细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平,检测细胞合成白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的表达。 结果与结论：高能量和低能量关节软骨损伤后,软骨细胞的存活率下降,原代细胞的贴壁细胞数量减少,贴壁时间延长,生长曲线下移,细胞甲苯胺蓝染色异染反应减弱,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度减弱,软骨细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平上升,细胞培养液中白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的质量浓度升高,其中高能量组效果更为显著(P < 0.05)。说明关节软骨损伤后软骨细胞的功能受到影响,受损程度与创伤强度及炎性细胞因子的表达相关。     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用☆

背景：近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相互作用的报道。 目的：观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用。 方法：获取脂肪来源间充质干细胞,以2×105 cells/cm2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞。2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况。RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9 mRNA的表达。 结果与结论：加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色。RT-PCR检测显示胰岛素样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义。提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用。     

兔软骨细胞与骨髓基质细胞的平面共培养：两者培养比例筛选

背景：骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨。 目的：拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间和传代次数。 方法：软骨细胞与骨髓基质细胞的分离培养,传代后分为5组：单纯软骨细胞组;共培养组,软骨细胞与骨髓基质细胞7∶3,5∶5,3∶7组;以及单纯骨髓基质细胞组。传代至第4代(G4),倒置相差显微镜观察各组细胞在不同传代时期的细胞形态,MTT实验检测细胞增殖活性,甲苯胺蓝与阿利新蓝染色,细胞免疫化学法检测Ⅱ型胶原的表达。 结果与结论：共培养各组在各个时期细胞表型正常。G1~G3代细胞增殖活跃,G4代细胞增殖能力下降。共培养各组甲苯胺蓝与阿利新蓝染色以及Ⅱ型胶原表达在G2和G3代均较高。综合各指标认为,以软骨细胞与骨髓基质细胞的比例为5∶5,3∶7组为最佳。软骨细胞与骨髓基质细胞平面共培养,保持了软骨细胞的形态和蛋白表达特性,如进行细胞移植,选取软骨细胞与骨髓基质细胞5∶5或3∶7的比例为最佳。     

自组装短肽水凝胶体外三维培养兔关节软骨细胞

背景：自组装短肽是人工设计合成的一类新型纳米生物材料，与软骨细胞复合培养后如能促进细胞基质的分泌，细胞分裂增殖及细胞表型的维持，将有可能成为一种较理想的细胞支架应用在软骨组织工程中。 目的：观察兔关节软骨细胞在纳米自组装短肽KLD-12水凝胶中三维培养的生物学特性。 设计、时间及地点：观察性实验，于2007-11/2008-04在四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所实验室完成。 材料：纳米短肽KLD-12序列为：Ac-KLDLKLDLKLDL-CONH2，由上海波泰生物公司合成。 方法：取新西兰兔关节软骨，通过酶消化法获取软骨细胞，体外培养2代后以5×109 L-1的密度接种于4 g/L的自组装短肽KLD-12溶液中，用磷酸盐缓冲液诱导成胶后进行三维培养。 主要观察指标：①通过倒置相差显微镜观察软骨细胞在纳米短肽水凝胶中的形态。②用甲苯胺蓝染色，免疫组化检测细胞外基质分泌情况。③反转录–聚合酶链反应检测软骨细胞黏多糖、前Ⅱ型胶原、前Ⅰ型胶原基因的表达情况。 结果：①兔关节软骨消化分离的软骨细胞成活率达95%以上。②软骨细胞在纳米短肽水凝胶中体外培养时，细胞生长旺盛、增殖活跃，细胞为圆形聚集成团状或岛状，细胞团周围有类似的软骨陷窝形成。③甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性, 细胞基质中黏多糖、Ⅱ型胶原含量随培养时间延长逐渐增加。④反转录–聚合酶链反应结果显示软骨细胞在纳米短肽水凝胶经过3周体外培养一直保持了分泌黏多糖及表达Ⅱ型胶原的能力。 结论：自组装短肽KLD-12三维水凝胶能较好维持软骨细胞正常形态、功能和增殖能力。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。 目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。 方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。 结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10 μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长

背景：目前软骨支架材料的种类比较多,但还没有一种材料能完全符合软骨修复的要求。 目的：观察在混合材料胶原-壳聚糖支架中软骨细胞的生长情况。 方法：采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架。将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,对照组将软骨细胞接种到无支架的培养板中。观察支架的孔隙率、吸水性及内部形态结构,MTT法检测软骨细胞在支架上的增殖情况,组织切片苏木精-伊红染色,扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况,RT-PCR检测细胞支架复合物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达情况。 结果与结论：胶原-壳聚糖支架的吸水性为(80.0±0.55)%,孔隙率为(88.5±1.5)%,孔径为100~150 μm,复合细胞培养2周后,细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组。说明质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化*☆

背景：实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达。 目的：通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响。 方法：将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组。分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察。 结果与结论：空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色。诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组(P < 0.05);各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组 (P < 0.05)。提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用。虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距。     

生长分化因子5诱导大鼠软骨前体细胞向成软骨方向分化

背景：生长分化因子5和软骨前体细胞都在肢体纵向发育中发挥重要作用。目前尚无生长分化因子5对软骨前体细胞影响的文献报道。 目的：实验创新性构思重组生长分化因子5干预软骨前体细胞,希望得到生长分化因子5诱导软骨前体细胞向软骨细胞分化的证据。 设计、时间及地点：细胞形态学体外实验,于2007-11/2008-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成。 材料：纯系清洁级新生 24 h 内的 SD 大鼠 12 只,用于制备软骨前体细胞。生长分化因子5为PeproTech公司产品。 方法：免疫磁珠分离纯化软骨前体细胞。取第3代细胞,分别用含0,10,50和100 μg/L的完全软骨形成培养基干预,诱导14 d。对照组采用低糖DMEM培养基。 主要观察指标：光镜观察细胞形态和生长增殖,四甲基偶氮唑盐检测细胞增殖活性,阿利新蓝染色蛋白聚糖,应用免疫组织化学和反转录-聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原的表达。 结果：分离纯化的软骨前体细胞贴壁牢固,生长旺盛,折光度好,光镜下呈多角形或梭形。 软骨前体细胞的增殖在48 h内呈剂量依赖性增高,100 μg/L生长分化因子5组细胞的增殖率显著高于其他组(P < 0.05)。诱导14 d后阿利新蓝染色阳性,细胞外基质中有明显的蛋白聚糖形成。在生长分化因子5干预软骨前体细胞第7天,Ⅱ型胶原mRNA和Ⅱ型胶原蛋白出现表达,并且14 d持续表达。 结论：生长分化因子5能够促进软骨前体细胞的增殖分化。     

胶原支架复合兔骨髓间充质干细胞体外模拟的微重力培养

背景：骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导的方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导、与软骨细胞体外共培养诱导和基因转染诱导培养等。 目的：验证模拟微重力条件下诱导后的兔骨髓间充质干细胞在Ⅰ、Ⅱ型胶原支架上黏附、伸展和增殖情况。 方法：对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养，按加入诱导条件不同分为2组：实验组(转化生长因子β1+ 胰岛素样生长因子1诱导)组、空白对照组。3周后分别作MTT比色试验、糖胺聚糖检测和免疫组织化学染色。将诱导后的实验组细胞分别种植于Ⅰ、Ⅱ型胶原支架，分为4组培养：复合Ⅱ型胶原支架静置培养、复合Ⅱ型胶原支架模拟微重力培养组、复合Ⅰ型胶原支架静置培养、复合Ⅰ型胶原支架模拟微重力培养组，1周后作苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色。 结果与结论：实验组MTT吸光度值和糖胺聚糖水平检测结果均大于空白对照组，且Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色显示，Ⅱ型胶原支架复合细胞的数量明显高于Ⅰ型胶原支架；模拟微重力培养条件下胶原支架复合细胞的数量明显高于静置培养组。结果说明微重力培养环境有利于高密度细胞的黏附、增殖，有利于细胞之间的信号传递，为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境；作为诱导后骨髓间充质干细胞的支架材料Ⅱ型胶原支架优于Ⅰ型胶原。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响*

摘要 背景：透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢？ 目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。 方法：全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21 d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。 结果与结论：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。 关键词：透明质酸;骨髓间充质干细胞;软骨细胞;分化;细胞外基质 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.001     

地塞米松磷酸钠对体外培养关节软骨细胞增殖的影响

背景: 研究表明，地塞米松可以使关节软骨表层基质中的Ⅱ型胶原减少，Ⅰ型胶原增多，但糖皮质激素对关节软骨细胞增殖作用的机制尚不十分清楚。 目的：验证地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞增殖的影响。 设计：对比观察。 材料：1月龄新西兰白兔用于软骨细胞的分离与培养。 方法：兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组，对照组用不含地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养，实验组则分别加入含不同质量浓度地塞米松磷酸钠(0.02，0.1，0.5 g/L)的DMEM培养液。 主要观察指标：①原代及传代兔关节软骨细胞的形态学观察。②应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖及其合成Ⅱ型胶原能力。③透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化。 结果：实验组软骨细胞贴壁、增殖较对照组缓慢。各实验组Ⅱ型胶原平均灰度值均显著高于对照组(P < 0.05)。实验组软骨细胞进入S期、G2+M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G0/G1期的细胞比率增加。电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少。 结论：地塞米松磷酸钠抑制软骨细胞的增殖，可能与抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白的合成能力有关。     

异常应力条件下关节软骨的变化*

摘要 背景：关节软骨细胞的正常生理功能与其受到的正常应力刺激密切相关,研究应力在关节软骨退行性变中的作用对临床治疗软骨退行性改变具有重要意义。 目的：观察兔膝关节软骨在异常应力条件下的变化,探讨应力对于关节软骨正常生长代谢以及修复过程的影响。 方法：将42只新西兰大白兔随机分为对照组和制动2,4,6周组。采用兔伸膝制动动物模型,对制动2,4,6周及正常兔的膝关节全层软骨进行苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,比较制动前后软骨组织学、病理积分及Ⅱ型胶原分泌的变化情况。 结果与结论：随着制动时间的延长,关节软骨的退变程度逐渐加深,病理积分结果显示各组间差异具有显著性意义(P < 0.01)。免疫组织化学染色结果显示随着制动时间的延长,软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原先增多,后减少。说明异常应力可影响兔关节软骨细胞正常生理活动及其分泌Ⅱ型胶原的能力。 关键词：异常应力;关节软骨;Ⅱ型胶原;免疫组织化学;制动     

威灵仙干预体外培养兔膝关节软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA基因的表达

背景：有研究显示,威灵仙能够维持和促进软骨细胞合成蛋白多糖与Ⅱ型胶原,并可能通过抑制白细胞介素1水平的增高保护关节软骨,延缓骨关节炎的发展。 目的：在以往研究基础上,观察中药威灵仙对体外培养兔膝关节软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA基因表达的影响,探讨其治疗骨关节炎的作用及可能机制。 方法：取新西兰白兔膝关节软骨,剪碎后,采用酶消化法原代分离培养软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定后,取处于对数生长期第3代细胞随机分组,实验组分别加入0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 g/L威灵仙培养基,对照组仅加入普通培养基进行培养。倒置显微镜下观察原代培养的软骨细胞形态变化及甲苯胺蓝染色鉴定, MTT法检测不同质量浓度威灵仙对软骨细胞增殖影响,RT-PCR法检测转化生长因子β1 mRNA表达。 结果与结论：原代软骨细胞呈圆球形,悬浮状态,24 h后大部分细胞贴壁;传代后软骨细胞生长速度加快,融合成片,外观呈典型“铺路石”状;传4代后逐渐出现长梭形软骨细胞,传代培养至6代时,呈成纤维细胞样外观,生长速度明显减慢,传代周期延长。软骨细胞经甲苯胺蓝染色后细胞外基质可见蓝色异染颗粒,细胞核染成深蓝色。不同质量浓度威灵仙均能促进软骨细胞增殖,尤以0.5 g/L增殖效果明显,且增殖高峰出现在威灵仙干预后的第3天。0.05,0.1,0.5,1.0 g/L威灵仙均能促进软骨细胞转化生长因子β1 mRNA 表达,4组组间比较差异无显著性意义(P > 0.05),但作用的高峰为0.5 g/L组。威灵仙能促进软骨细胞增殖及转化生长因子β1 mRNA的表达,提示这可能是其治疗骨关节炎的作用及可能机制之一。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化*

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出“同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨”的实验设技。 目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。 结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01)。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。     

脂肪干细胞与软骨细胞共培养的实验研究

背景：有研究发现关节软骨微环境可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。 目的：验证软骨细胞能否诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,以便成为组织工程构建关节软骨可能的新方法。 设计、时间及地点：随机对照细胞实验,于2007-09/2008-07在南京大学生物医药生物技术国家重点实验室完成。 材料：清洁级成年新西兰大白兔,雌雄不限,体质量1.5~2.0 kg。 方法：分离培养原代新西兰大白兔脂肪干细胞和软骨细胞,分别种植于6孔板和插入式细胞培养皿共培养2周后,胰酶消化终止。脂肪干细胞分别行油红O染色、碱性磷酸酶检测和甲苯胺蓝染色法鉴定。 主要观察指标：倒置显微镜观察共培养前后脂肪干细胞的形态变化。甲苯胺蓝染色法检测共培养后脂肪干细胞的蛋白多糖的表达水平。免疫细胞化学检测共培养后脂肪干细胞的Ⅱ型胶原的表达水平。反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平。 结果：脂肪干细胞分别经油红O染色、碱性磷酸酶染色和甲苯胺蓝染色法鉴定证实,分离的细胞具有多向分化能力,是脂肪来源的间充质干细胞。共培养1周后部分脂肪干细胞变圆,2周时其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高。 结论：与软骨细胞共培养后,脂肪干细胞可以被诱导成软骨样细胞。     

结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型的影响

背景：在关节软骨损伤修复的过程中,由于目前实验室中常用的细胞因子存在半衰期短、价格昂贵等缺点,不能广泛应用于临床。 目的：假设结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型有一定的影响,为组织学方法修复关节软骨缺损寻找新的细胞因子。 设计、时间及地点：随机区组设计对照实验,于2007-08/2008-02在深圳龙岗中心医院完成。 材料：健康1月龄新西兰大白兔2只;结缔组织生长因子为Propetech公司产品。 方法：获取兔关节软骨组织,将其剪碎,Ⅱ型胶原酶消化法原代分离培养兔关节软骨细胞,待细胞铺满瓶底80%胰酶消化传代,取其第2代,细胞贴壁后随机分组,实验组分别加入30,50,100,150 μg/L的结缔组织生长因子,对照组仅加入DMEM培养液进行体外培养。 主要观察指标：采用倒置相差显微镜下观察细胞形态及数量改变,采用四唑盐(MTT)法检测不同浓度的结缔组织生长因子对软骨细胞增殖的影响,免疫组织化学法(SABC法)检测Ⅱ型胶原的表达情况。 结果：①结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞生长迅速,呈典型的软骨细胞形态,部分细胞聚集成团,形成软骨结节。②结缔组织生长因子能显著促进兔关节软骨细胞增殖,与对照组相比差异具有显著性意义(P < 0.01)。不同质量浓度的结缔组织生长因子均能促软骨细胞增殖,100 μg/L为最佳作用质量浓度(P < 0.01)。③结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达增多,且始终为阳性。 结论：结缔组织生长因子可以刺激体外培养的兔关节软骨细胞增殖,促进软骨特异性Ⅱ型胶原表达,维持软骨表型。结缔组织生长因子可能用来作为组织工程学修复软骨缺损,治疗骨关节炎的新的生长因子。     

脂肪基质细胞体外分离培养及成软骨定向诱导***☆

背景：组织工程技术是解决软骨等组织缺损的理想途径,但其种子细胞的来源问题仍未很好地解决。 目的：观察脂肪基质细胞体外分离培养及其在体外向成软骨细胞诱导分化的能力。 方法：取新西兰白兔皮下脂肪组织,以胶原酶等消化分离获得脂肪基质细胞,以成软骨诱导培养液对其进行成软骨诱导分化,倒置显微镜下观察脂肪基质细胞体外培养传代情况;免疫组织化学、阿尔辛蓝染色、天狼猩红染色等方法观察脂肪基质细胞成软骨诱导可行性;MTT法观察脂肪基质细胞与诱导培养的脂肪基质细胞体外增殖情况。 结果与结论：脂肪基质细胞可于体外分离培养,在成软骨诱导后,可定向分化为软骨样细胞,其可分泌软骨细胞特有的Ⅱ型胶原及酸性黏多糖。原代培养的脂肪基质细胞呈长梭形,胞核椭圆,第3天进入指数增长期,群体倍增时间为55 h左右,细胞在第4天进入平台期,体外传代培养9代后,细胞开始出现衰老征象;成软骨诱导细胞增殖速度显著增快,随诱导培养时间的延长,细胞体积明显增大,形态由长梭形变为宽大、多伪足的多角形,胞核亦变大,核仁明显,培养第2天进入指数增长期,群体倍增时间为30 h左右,在第8天进入平台期,经体外传代培养15代后,细胞增殖速度减慢,开始出现衰老征象。提示脂肪基质细胞在一定条件下可定向分化为软骨细胞,可作为软骨组织工程种子细胞来源。