TRAIL参与氧合血红蛋白诱导的脑血管内皮细胞凋亡

目的目前对自发性蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛（CVS）的机制尚不十分清楚,研究认为脑血管内皮细胞的凋亡发挥了重要作用。本实验探讨了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及caspase3在血管内皮细胞凋亡中作用。方法在离体培养的脑血管内皮细胞中,观察给予氧合血红蛋白（OxyHb）处理以及给予caspase3拮抗剂或TRAIL后,运用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测两者在mRNA和蛋白水平表达的改变。结果和生理盐水阴性对照相比,单纯OxyHb处理以及OxyHb＋TRAIL处理后,血管内皮caspase3表达均显著升高（P〈0．05）。TRAIL能够上调OxyHb刺激诱导的caspase3表达（P〈0．05）。和生理盐水对照组相比,OxyHb处理后,血管内皮TRAIL表达显著上调（P〈0．05）。但是,和OxyHb处理相比,caspase3拮抗剂Ac—DEVD—CHO（ADC）不能明显改变OxyHb刺激诱导的TRAIL蛋白的表达上调（P〉0．05）。结论TRAIL能够促进SAH后OxyHb刺激导致的内皮细胞凋亡。在凋亡的级联反应过程中,TRAIL能够活化下游caspase3,从而启动凋亡过程。因此,TRAIL及其受体在SAH后CVS的发生、发展过程中可能有着重要作用。     

缝隙连接阻断剂1-庚醇对血红蛋白诱导兔离体基底动脉环痉挛的抑制作用

目的 探讨缝隙连接在脑血管痉挛中可能发挥的作用。方法 通过兔离体基底动脉环试验,观察缝隙连接阻断剂1-庚醇(heptanol)对氧合血红蛋白(OxyHb)和高K+引起血管收缩的影响。结果10~(-4)mol/L OxyHb和60 mmol/L K+引起动脉环收缩后,累积加入10~(-4)-10~(-2)mol/Lheptanol可以显著降低其收缩程度,并呈浓度依赖关系。当浓度为500μmol/L时,OxyHb引起的血管收缩幅度下降60%,1 mmol/L时几乎完全抑制OxyHb引起的持续收缩。同浓度的heptanol对OxyHb致痉的抑制作用比对K+致痉的抑制作用强。heptanol(≥3×10~(-4)moL/L)预处理动脉环后,能有效抑制OxyHb引起的血管收缩(P<0.01)。结论 缝隙连接阻断剂heptanol能显著抑制OxyHb对脑血管的致痉作用,缝隙连接在脑血管痉挛中可能发挥重要作用。     

氧合血红蛋白对培养的血管平滑肌细胞形态及增殖的作用

目的 观察不同浓度氧合血红蛋白(oxyhemoglobin，OxyHb)对培养的血管平滑肌细胞(vascualr smooth muscle cell，VSMC)的作用。方法 将培养的VSMC根据OxyHb浓度分为1μmot／L、10μmol／L、100μmol/L、200μmol／L及正常对照组，通过观察形态学改变、MTT比色法分析评估其损害和增殖状况。结果 与对照组比较，OxyHb组VSMC出现明显的病理形态学改变，MTT比色显示各浓度组OxyHb作用后OD值-时间曲线呈现双向性特点，在作用初期较对照组呈现明显的下降趋势，此后出现大幅上升，在24h内OxyHb组OD值均明显低于对照组。高浓度组(100μmol/L、200μmoL／L)各时间点OD值均显著低于低浓度组(1μmol／L、10μmol／L。各浓度组相互比较有显著差异性。结论 OxyHh作用下的VSMC其增殖活性呈现双向性改变，与临床经过相一致，抗VSMC增殖可能在慢性脑血管痉挛治疗中具有一定意义。     

纤维蛋白对大鼠脑血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的观察纤维蛋白对大鼠脑血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)转录及蛋白水平表达的影响。方法大鼠脑血管内皮细胞分离后培养,加入不同浓度的纤维蛋白,通过Real-time PCR检测VEGF转录水平,应用酶联免疫方法(ELISA)定量检测培养基和细胞裂解液中的VEGF水平。结果纤维蛋白可以特异性诱导大鼠脑血管内皮细胞表达VEGF;加入不同浓度的纤维蛋白(0.03mg/ml、0.1mg/ml、0.3mg/ml和1.0mg/ml),24h后,1.0mg/ml纤维蛋白组的培养基VEGF水平显著增高(P<0.001);1.0mg/ml纤维蛋白与大鼠脑血管内皮细胞分别培养0、2、4、8、24、48h,VEGF浓度在共培养2h已经升高,8h时显著升高,在24h时仍然保持在显著升高表达水平(P<0.005),48h有所下降;Real-time PCR结果提示,大鼠脑血管内皮细胞中VEGF mRNA的上调呈现出剂量和时间依赖性增加。结论纤维蛋白可以上调大鼠血管内皮细胞中的VEGF。     

神经生长因子对氧合血红蛋白诱导鼠神经细胞凋亡的作用研究

目的 研究神经生长因子(NGF)对氧合血红蛋白(OxyHb)诱导的小鼠神经细胞凋亡的作用,进一步探讨OxyHb诱导细胞凋亡及NGF对神经元保护作用的可能机制.方法 蛛网膜下腔注射OxyHb建立蛛网膜下腔出血的动物模型,尾静脉注射NGF,TUNEL法检测神经细胞凋亡,免疫组织化学法检测Bcl-2、Bax、P75NTR和TrkA表达的情况.结果 注射OxyHb后出现神经细胞凋亡,Bcl-2表达降低,Bax和P75NTR表达增加,在NGF给药组,神经细胞凋亡数明显减少,Bcl-2表达增加.而Bax和P75NTR表达则明显降低.结论 小鼠局部脑组织蛛网膜下腔注射OxyHb可引起小鼠神经细胞发生凋亡,Bax和P75NTR表达增加可能是诱导凋亡的一个主要原因,而静脉注射NGF可以抑制OxyHb诱导的细胞凋亡,其机制可能是通过与受体结合,增加Bel-2蛋白表达,降低Bax和P75NTR表达水平以实现其保护作用.     

不同浓度氧合血红蛋白对平滑肌细胞核因子-κB DNA结合活性的影响

目的 观察氧合血红蛋白(OxyHb)对培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)细胞密度及核因子(NF)-κB的DNA结合活性的影响.方法 用不同浓度(1～100 μmol/L)的OxyHb处理VSMCs,观察其形态学及细胞密度变化,测定NF-κB的DNA结合活性.结果 OxyHb刺激后VSMCs都表现出形态学的改变,其严重程度有浓度依赖性.但是在24 h时只有100 μmol/L组有明显的细胞数量减少,10μmol/L组在48 h时细胞数量开始明显减少.NF-κB的DNA结合活性在经OxyHb处理后明显增高,以10μmol/L及50μmol/L组最高.结论 NF-κB的DNA结合活性在经OxyHb处理的VSMCs中有明显改变,揭示了NF-κB在脑血管痉挛发生时是脑血管平滑肌细胞内重要的信号通路.     

二十二碳六烯酸预处理增强大鼠脑胶质细胞对氧糖剥夺条件下脑血管内皮细胞的保护作用

目的评价二十二碳六烯酸(DHA)预处理是否增强脑胶质细胞对氧糖剥夺(OGD)条件下脑血管内皮细胞的保护作用。方法原代培养的胶质细胞,分别在正常氧含量或低氧条件培养24 h,收集各组培养上清液。再将原代培养的血管内皮细胞按实验设计分别与胶质细胞培养上清液共培养。利用流式技术检测凋亡率,Western检测Bax、bcl-2、caspase-3、p Tie-2、p Akt、ZO-1。结果经DHA预处理后的胶质细胞培养上清液能够降低低氧条件下血管内皮细胞的凋亡(P<0.01),降低Bax、caspase-3的表达(P<0.01),而增加bcl-2、bcl-2/Bax、p Tie-2、p Akt、ZO-1表达(P<0.01)。结论 DHA预处理能够增强脑胶质细胞对氧糖剥夺条件下血管内皮细胞的保护作用。其机制可能与增加Ang1分泌、激活Tie-2受体、从而促进抗凋亡作用相关。     

内皮素、内皮松驰因子及其氧合血红蛋白在脑血管痉挛中的作用

在颅内出血病人中,氧合血红蛋白(OxyHb)引起自由基、内皮素释放,脂质过氧化物产生,血管和周围神经损害以及内皮依赖性松驰因子抑制;破坏了血管的舒张与收缩平衡,引起脑血管的痉挛。其中内皮素(ET)除强大、持久的血管收缩作用外,还具有离子运输、神经传递、下丘脑—垂体功能调节、花生四稀酸生成和基因调控等作用。OxyHb与一氧化氮(NO)有极高的亲和力和促进ET的表达和释放,构成了脑内出血病人血管痉挛主要的病理基础。     

一定浓度下三氧化二砷对T细胞淋巴瘤Hut-78细胞株增殖的影响

背景：近年来有将三氧化二砷试用于T细胞肿瘤的有效报道,但未见其治疗机制的相关研究。 目的：检测三氧化二砷对人皮肤T细胞淋巴瘤Hut-78细胞的抑制增殖、诱导凋亡及细胞周期的影响。 方法：分别采用MTT、PI单标记流式细胞术和TUNEL法检测2,5,10 μmol/L的三氧化二砷干预24,48,72 h, 对人皮肤T细胞淋巴瘤Hut-78细胞株抑制增殖、诱导凋亡和细胞周期的影响,及其凋亡相关基因bcl-2及血管内皮细胞生长因子基因表达的变化。 结果与结论：在一定的浓度范围内,三氧化二砷对Hut-78细胞存在增殖抑制作用,其增殖抑制作用在一定程度上可能与下调血管内皮细胞生长因子基因的表达有关,同时还存在一定的细胞毒作用;三氧化二砷可诱导Hut-78细胞发生凋亡,凋亡机制主要发生在G2~M期,其凋亡作用可能与下调bcl-2基因表达有关。三氧化二砷对Hut-78细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用呈时间剂量依赖性。     

氧合血红蛋白在脑血管痉挛发病机制中的作用

蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛是引起病人死亡和致残的主要原因之一，发病机制尚不十分明确。近年来氧合血红蛋白（OxyHb）在其中的作用得到了愈来愈多的重视，被认为是引起脑血管痉挛的主要启动因素，本文就OxyHb与脑血管痉挛的关系进行综述。     

Oxyhemoglobin produces apoptosis and necrosis in cultured smooth muscle cells

Confluent rat aortic smooth muscle cells were treated with OxyHb in a concentration- and time-dependent manner. A high concentration of OxyHb (100 microM) within 24 h decreased cell density. DNA analysis showed a smear pattern characteristic of cell necrosis. Transmission electron microscopy demonstrated disintegration of the cell membrane and destruction of cell organelles. Western blotting using PARP antibody revealed that 116 kDa PARP was not cleaved to 85 kDa, an apoptosis-related fragment. On the contrary, a low concentration of OxyHb (10 microM) produced apoptotic cell death at 72 h that was supported by DNA analysis and TUNEL staining. These results demonstrated that a high level of OxyHb induced necrosis within 24 h and a low concentration of OxyHb produced apoptosis after 72 h in cultured smooth muscle cells. Morphological alterations induced by OxyHb might contribute to the vascular wall changes in the cerebral arteries following subarachnoid hemorrhage (SAH).     

The effect of ecdysterone on cerebral vasospasm following experimental subarachnoid hemorrhage in vitro and in vivo

OBJECTIVES: Cerebral vasospasm has been the dreaded complication of ruptured intracranial aneurysms. Worldwide effort has led to many promising experimental treatments but none was confirmed to be effective in clinical trials. Ecdysterone is an insect steroid hormone. Our previous study showed that ecdysterone might prevent cerebral vasospasm in vitro. Even after all these works, rare attempts have been made to test the effect of ecdysterone on vascular adventitial fibroblast (VAF) proliferation, a process known to play an important role in various pathogenic vascular conditions. Thus, we tested the hypothesis that ecdysterone could affect VAF characteristics and have an effect on SAH induced cerebral vasospasm. METHODS: OxyHb of 100 microM was used in the in vitro study to mimic the clinical situation. The effect of OxyHb on the cell proliferation and migration of cultured aortic smooth muscle cells was investigated. In the in vivo study, 20 rabbits were equally divided into four groups: control group, SAH group, SAH/nimodipine group and SAH/ecdysterone group. Changes in neurological function and cerebral angiograms were observed after SAH. RESULTS: OxyHb increased the proliferation of vascular adventitial fibroblasts at 24 hours. Ecdysterone co-treatment was apparently similar to the suppression of proliferation. Cell cycle analysis indicated that ecdysterone inhibited the progression of vascular adventitial fibroblasts from G1 to S. The results of the migration assay showed that 100 microM OxyHb obviously prompted vascular adventitial fibroblast migration and that ecdysterone would attenuate this effect. In the SAH/nimodipine and SAH/ecdysterone groups, neurological deficit, cerebral vasospasm and structural changes in basilar artery were alleviated with nimodipine or ecdysterone treatment. CONCLUSION: Ecdysterone could affect vascular adventitial fibroblast characteristics and attenuate vasospasm after SAH.     

胶质瘤干细胞来源的外泌体对血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的探讨胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)来源的外泌体对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)的增殖和迁移的影响。方法培养和分离人胶质瘤U87细胞系来源的胶质瘤干细胞(GSCs),对培养的肿瘤球细胞及其诱导分化的细胞采用免疫组织化学染色的方法鉴定。然后提取胶质瘤干细胞分泌的外泌体(GSCs-exo),分别添加不同浓度的GSCsexo (20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml)处理人脑微血管内皮细胞(HBMECs)。在处理结束后,采用CCK-8法检测GSCs-exo对血管内皮细胞增殖的影响、Transwell小室检测GSCs-exo对细胞迁移能力的影响。结果肿瘤球细胞培养状态下呈悬浮生长,免疫组织化学荧光染色法证明培养的肿瘤球细胞中特异性表达CD133和Nestin,其诱导分化的细胞染色可见GFAP和Neun表达阳性。随着GSCs-exo浓度的升高,促血管内皮细胞的增殖能力逐渐增强,迁移能力也大大提高(P 0. 05)。结论在胶质瘤微环境中,胶质瘤干细胞来源的外泌体可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移,GSCs-exo可能是胶质瘤血管形成的关键因素。     

高浓度谷氨酸诱导胶质瘤细胞凋亡及其机制

目的：研究高浓度谷氨酸对原代培养人脑胶质瘤细胞的凋亡诱导作用,进一步探讨其凋亡的可能机制。方法：对新鲜的人脑胶质瘤进行体外原代培养,不同浓度的谷氨酸作用不同时间,形态学观察;四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测肿瘤细胞生长抑制率;流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率;激光共聚焦显微镜检测细胞膜内游离钙离子的浓度变化。结果：原代培养胶质瘤细胞的生长抑制率随谷氨酸浓度的增加呈递增趋势。25、50和100mmol/L谷氨酸作用胶质瘤细胞48h的凋亡率分别为9.65%、31.13%和20.35%。脑胶质瘤原代培养细胞内钙离子浓度在谷氨酸作用后明显升高,与对照组相比有显著性差异（P〈0.01）;但不同浓度组、24h和48h组之间钙离子的浓度无显著性差异（P〉0.05）。结论：高浓度的谷氨酸可诱导原代培养人脑胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在一定范围内呈明显的剂量依赖性。钙离子在谷氨酸诱导的细胞凋亡中起重要作用。     

Bilirubin produces apoptosis in cultured bovine brain endothelial cells

Blood components such as oxyhemoglobin are believed to cause cerebral vasospasm by inducing contraction and cell death in cerebral arteries. We have observed previously that oxyhemoglobin produces apoptotic changes in cultured endothelial cells. This study was undertaken to explore if bilirubin, a bi-product of hemoglobin degradation, will produce similar cytotoxicity in endothelial cells. Cultured bovine brain microvascular endothelial cells were incubated in four concentrations of bilirubin (10, 25, 50, and 100 microM) for varying times (6, 12, and 24 h). Control cells were incubated in saline or vehicle (NaOH solution, <0.01% of 0.01 N) for similar time periods. The cultured cells were then observed microscopically for evidence of cellular alterations. Bilirubin (10-100 microM) produced apoptosis that appeared time-dependent but not clearly concentration-dependent. Biochemical markers for apoptosis such as DNA fragmentation and PARP cleavage were induced by bilirubin. We conclude that endothelial cells may undergo apoptosis after exposure to bilirubin.     

小鼠endostatin抑制血管内皮细胞增殖的作用机制研究

目的探讨小鼠endostatin抑制血管内皮细胞增殖的作用机制.方法在含重组小鼠 endostatin 蛋白(150 nmol/L)和小牛血清(100 ml/L)的DMEM培养基中培养人脐静脉内皮细胞ECV304, 72 h后,采用透射电镜、流式细胞仪进行细胞周期分析和细胞核DNA的1.5%琼脂糖凝胶电泳,检测重组小鼠endostatin蛋白作用后血管内皮细胞的凋亡.结果透射电镜下可见实验组ECV304细胞核染色质浓缩、边集、核碎裂及胞浆浓缩等,呈典型的凋亡细胞形态学表现.流式细胞仪细胞周期分析显示,在G1期峰前存在1个凋亡峰.1.5%琼脂糖凝胶电泳显示,细胞核DNA呈梯状.对照组ECV304细胞表现正常.结论重组小鼠endostatin蛋白可诱导血管内皮细胞凋亡,是其抑制血管内皮细胞增殖的原因之一.