重组人类肝细胞生长因子对胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因的影响

目的探讨重组人类肝细胞生长因子（rhHGF）对胶质瘤细胞垂体瘤转化基因（PTTG）的影响。方法体外培养胶质瘤C6细胞,给予不同浓度的rhHGF（0、10、20、30μG/L）,半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测PTTGmRNA表达,Western blot检测P1TG蛋白表达。结果不同浓度rhHGF作用后C6细胞PTFGmRNA表达与蛋白水平均增高,且随着浓度的增加,其升高越明显,各组间差异有统计学意义（P〈0．01）。结论rhHGF可上调PTTG的表达,且呈剂量依赖性。     

垂体瘤转化基因RNA干扰对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响

目的 观察垂体瘤转化基因(PTTG)RNA干扰对胶质瘤细胞对化疗药物敏感性的影响.方法 实验分4组:对照组:对胶质瘤U251细胞不进行任何处理;替莫唑胺(TMZ)组:胶质瘤U251细胞培养基中加入TMZ;PTTG shRNA转染组:PTTG shRNA片段转染胶质瘤U251细胞;PTTG shRNA联合TMZ组:TMZ作用于转染PTTG shRNA片段的胶质瘤U251细胞.MTT法检测细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 MTT结果显示吸光度值在对照组、TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组分别为0.85±0.07、0.58±0.06、0.55±0.07、0.41±0.05,TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组细胞增殖抑制率分别为(31.56±5.51)%、(35.53±4.60)%、(51.49±6.74)%;PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组抑制细胞增殖更明显,与PTTG shRNA组及TMZ组比较差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,48 h时对照组凋亡率为(6.29±0.78)%,TMZ组为(33.61±4.88)%,PTTG shRNA组为(39.61±4.95)%,PTTG shRNA联合TMZ组为(66.23±7.60)%,PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组的凋亡率较PTTG shRNA组及TMZ组明显增高,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PTTGRNA干扰可以增强胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高化疗效果.     

垂体肿瘤转化基因在胶质瘤中的表达及意义

目的探讨垂体瘤转化基凶(PTTG)及与之密切相关的碱性成纤维生长因子(bFGF)在胶质瘤组织中的表达规律,探讨其与肿瘤增殖、肿瘤血管生成、临床病理之间的关系。方法用RT-PCR分析了32例胶质瘤组织和6例正常脑组织标本PTTG mRNA的表达；用SP法检测bFGF、PCNA及CD34在肿瘤中的表达,计算微血管密度(MVD),并结合临床病理资料进行分析。结果胶质瘤组织中PTTG基因呈过度表达,高级别(Ⅲ～Ⅳ级)胶质瘤组织中PTTG mRNA的平均表达水平(0．91±0．34)显著高于低级别(Ⅰ～Ⅱ级)胶质瘤(0．47±0．33)及正常脑组织(0．11±0．17),3组间分别比较,差异均有显著性意义(P＜0．05)；生存时间1≥2年组中PTTG mRNA的表达水平(0．52±0．39)低于生存时间＜2年组(0．97±0．26),两者比较差异有显著性意义(P=0．001)；低级别和高级别胶质瘤组的bFGF、PCNA及MVD相比均有显著差异性(P＜0．05)；PTTG mRNA和MVD、PCNA、bFGF之间存在显著正相关；与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小均无相关关系。结论PTTG参与胶质瘤的早期发生。bFGF则对血管形成、肿瘤增殖有明显作用,二者均和肿瘤的侵袭性密切相关。     

CDglyTK双自杀基因杀伤C6胶质瘤细胞的体外实验研究

目的观察CDglyTK双自杀基因对C6胶质瘤细胞的杀伤作用及旁观者效应。方法利用逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)融合基因转染C6胶质瘤细胞,通过细胞集落形成试验、细胞生长抑制率(GIR)测定(MTT法),检测和分析CD/5-氟胞嘧啶(5-FC)、HSV-tk/更昔洛韦(GCV)双自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应。结果RT-PCR检测分析融合基因的表达,显示逆转录病毒介导的双自杀基因在C6胶质瘤细胞中表达。不加5-FC和GCV时,转染组和对照组肿瘤细胞集落形成和倍增时间分别为94h、96h和25.7h、26.6h,组间差异比较无显著意义(P>0.05)。在5-FC(80.0mg/L)和GCV(10-1mg/L)浓度下,GIR分别为83.36%、7.08%,差异比较有显著意义(P<0.01)。转染C6胶质瘤细胞在混育细胞中比例占5%时,即可获得明显的旁观者效应,细胞生长抑制率可达38.48%。结论CDglyTK融合基因联合双前药治疗能取得显著的抗胶质瘤作用。     

siRNA下调Caveolin-1表达对体外培养C6胶质瘤细胞影响

目的 观察siRNA下调Caveolin-1(Car1)表达的效果及对体外培养C6胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响.方法 构建Car1 mRNA质粒,转染体外培养c6胶质瘤细胞,利用Transwell体外侵袭实验和"划痕"实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力,采用Western blot和RT-PCR的方法检测Cav1、EGFR、Pyk2的表达情况.结果 所构建的Cav1 siRNA质粒转染体外培养C6胶质瘤细胞可明显下调Cav1的表达,干扰成功后C6胶质瘤细胞的侵袭能力和迁移能力明显下降,同时EGFR和Pyk2的表达明显减少.结论 siRNA下调Cav1可降低体外培养C6胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力.     

声动力化学疗法对体外C6胶质瘤细胞作用的研究

目的研究声动力化学疗法(SDT)对体外C6胶质瘤细胞作用效果,试图探索一种治疗脑胶质瘤的新方法。方法采用MTT法观察SDT后的各时段、加不同氧活性物质(ROS)后的抑瘤率;流式细胞学检测C6细胞的凋亡率及细胞周期百分比;透射电镜观察C6细胞亚细胞结构变化。结果SDT后抑瘤率显著增高;超声组也有一定的抑瘤率;血啉甲醚(HMME)组抑瘤率与对照组无明显差别。与SDT组比较,加NaN_3抑瘤率显著降低,加过氧化氢酶及SOD抑瘤率亦较SDT组低,加甘露醇抑瘤率无明显变化。SDT后凋亡率升高,G_0/G_1期、G_2/M期百分比降低,S期百分比升高、凋亡增殖比(APR)升高。透射电镜观察对照组C6细胞无明显变化,SDT组细胞呈现凋亡或坏死状态。结论SDT能显著杀伤体外C6胶质瘤细胞。     

CDglyTK双自杀基因杀伤C6胶质瘤细胞的体内实验研究

目的 观察CDgtyTK双自杀基因对C6实体胶质瘤生长的抑制作用. 方法 利用逆转录病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)融合基因转染小鼠C6实体胶质瘤,RT-PCR检测分析融合基因的表达,并观察对照组和治疗组肿瘤体积、重量、抑瘤牢及生存期的变化,同时观察其对C6胶质瘤细胞凋亡的影响,分析CDglyTK双自杀基因系统对肿瘤的抑制作用. 结果 RT-PCR检测显示逆转录病毒介导的COgtyTK双自杀基因在C6胶质瘤中有表达.对照组第4周肿瘤已长至20 mmx30 mm大小.并出现小鼠死亡现象,至第6周末全部死亡;治疗组肿瘤体积未增长,约5 mm大小.部分肿瘤消失.肉眼观察可见对照组肿瘤体积大,色红,血供丰富,治疗组肿瘤体积减小或消失.21 d后处死取瘤称重,对照组[(2.51±0.58)g]与治疗组肿瘤质量[(0.35±0.26)g]比较差异有统计学意义(P<0.05),治疗组抑瘤牢为86.1%.流式细胞仪检测可见治疗组细胞凋亡率(34.41%±5.20%)明显高于对照组(2.92%±1.30%),差异有统计学意义(P<0.05).电镜观察可见治疗组肿瘤细胞凋亡小体形成. 结论 效 CDglyTK双自杀基因联合双前药治疗能取得显著的抗胶质瘤作用.     

垂体瘤转化基因在垂体大腺瘤中表达的研究

目的 探讨垂体瘤转化基因（PTTG）在垂体大腺瘤中的表达及意义。方法收集经手术和病理证实的垂体大腺瘤患者40例，其中无功能腺瘤22例，生长激素（GH）腺瘤8例，泌乳素（PRL）腺瘤10例。同期经手术和病理证实的垂体微腺瘤11例为对照组，其中促肾上腺皮质激素（ACTH）腺瘤8例。PRL腺瘤3例。采用免疫组化技术（LSAB法）检测垂体大腺瘤和垂体微腺瘤中PTTG的表达水平。结合临床资料及影像学分级标准，分析PTTG表达水平与垂体大腺瘤发生机制、生物学行为之间的联系。结果40例垂体大腺瘤中均发现PTTG的表达显著高于垂体微腺瘤组（P〈0．01）。在侵袭性垂体大腺瘤中，PTTG的表达显著高于非侵袭性垂体大腺瘤（P〈0．01）。PTTG的表达与大腺瘤向鞍上生长的高度和向海绵窦侵袭性生长的程度显著相关（P〈0.05）。结论PTTG表达增高与垂体大腺瘤的生长以及肿瘤的侵袭性密切相关。PTTG的表达水平及结合影像学资料可以为患者预后及术后的辅助治疗提供可靠的判断依据。     

卡莫司汀对C6胶质瘤细胞凋亡作用机制的研究

目的研究卡莫司汀(BCNU)对胶质瘤凋亡的作用机制。方法取生长状态良好的C6胶质瘤细胞悬液,按1×107个细胞/25μl的密度接种于20只SD大鼠腹股沟区皮下,观察其生长情况。将16只成瘤大鼠随机等分为治疗组与非治疗组,前者按相同剂量隔日腹腔内注射BCNU。治疗2周后处死全部大鼠,取大鼠右侧腹股沟区皮下肿瘤行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色,检测胶质瘤的病理学特征及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、bax和bcl-2蛋白的表达情况,观察瘤细胞凋亡情况。结果C6胶质瘤细胞皮下接种4～5d后,大鼠腹股沟区皮下形成实体瘤;治疗2周,非治疗组和治疗组SD大鼠平均肿瘤质量差异有统计学意义(P<0.01),治疗组肿瘤抑制率为29.6%。肿瘤GFAP表达为阳性;BCNU治疗后bax基本无改变,bcl-2下调明显(P<0.01),bax/bcl-2比值明显增加。结论BCNU腹腔注射治疗大鼠神经胶质瘤导致胶质瘤细胞凋亡,其主要机制可能与下调凋亡蛋白bcl-2的表达和升高bax/bcl-2的比值有关。     

突变型胸苷激酶对鼠C6胶质瘤细胞的杀伤效应

目的 观察比较突变型单纯疱疹胸苷激酶(HSV1-sr39tk)/更昔洛韦(GCV)和野生型HSV1-tk/GCV对鼠C6胶质瘤细胞的杀伤效应.方法 利用真核表达载体转染目的 基因到C6细胞,RT-PCR鉴定.通过MTT实验和活体植瘤,比较各组对GCV敏感性.结果 成功获得分别转染有HSV1-tk(C6/tk)和HSV1-sr39tk(C6/sr39tk)、的C6细胞.GCV浓度在0～400μmol/L时,C6/sr39tk细胞存活率由(99.96±3.54)%下降到(4.75±1.79)%;C6/tk细胞存活率从(100.03±2.95)%降至(59.16±3.48)%,未转染组细胞存活率则从(100.29±1.20)%到(83.62±7.56)%.同一GCV浓度时,各组间细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05).各组细胞在活体均能致瘤,GCV治疗10 d后,C6、C6/tk和C6/sr39tk组肿瘤大小分别为(1287.24±364.84)mm3、(928.47±165.61)mm3和(574.08±107.72)mm3,较治疗前均有一定程度的生长,但后两组生长较前组明显减缓,以C6/sr39tk组生长减缓最明显.组间比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 体外和体内实验证实HSV1-sr39tk比HSV1-tk对GCV更敏感,可提高其与GCV所组成的自杀基因系统对C6胶质瘤细胞的杀伤效应.     

姜黄素对人胶质瘤SHG44细胞侵袭、迁移的影响

目的 探讨姜黄素对人胶质瘤SHG44细胞侵袭和迁移的影响。方法 胶质瘤SHG44细胞使用含10％胎牛血清DMEM培养基培养,终浓度分别5、10、20、40 μmol/L姜黄素作用24、48、72 h;对照组加入等量二甲基亚砜。CCK-8比色法检测细胞增殖活力;细胞划痕实验检测细胞迁移距离及迁移率;Transwell实验细胞侵袭能力;免疫印迹法检测胶质瘤SHG44细胞基质金属蛋白酶（MMP）2、9表达。结果 姜黄素对SHG44细胞生长具有显著抑制,且呈时间与浓度依赖性（P<0.05）;最佳作用浓度在10~20 μmol/L。与对照组相比,姜黄素作用后,SHG44细胞迁移距离、迁移率、侵袭能力明显降低（P<0.05）,SHG44细胞MMP2、MMP9蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。结论 姜黄素可抑制胶质瘤SHG44细胞的增殖,进而抑制细胞的迁移及侵袭能力,且呈时间及浓度依耐性,其机制可能与下调MMP2和MMP9蛋白表达有关。     

siMDR1基因转染人类BT325胶质瘤细胞系的表达

目的探讨siMDR1基因转染人类胶质母细胞瘤细胞BT325后细胞的表达能力。方法设计并合成siRNA质粒,取培养对数期生长良好的胶质母细胞系BT325,传代培养。将阳离子脂质体(Lipofectamine 2000)和质粒MDR1 DNA按比例共转染。瞬时对转染成功的细胞系应用抗性药物-嘌呤霉素进行筛选,筛出稳定的细胞系后,分别在荧光显微镜下分析转染情况。通过免疫细胞化学染色及图像分析对瞬时转染和稳定转染的BT325细胞进行检测,确定MDR1基因产物P-糖蛋白(P-gp)表达水平。阿霉素对瞬时转染及稳定转染的BT325耐药性进行分析。结果成功构建了逆转录病毒si RNA质粒载体,经过瞬时转染BT325细胞生长状态良好,48h表达绿色荧光最强。加入嘌呤霉素筛选后,在第8天出现单细胞克隆。免疫细胞化学染色证实瞬时转染与稳定转染BT325细胞P-gp的表达下降。细胞的转染效率为70%～80%。BT325细胞经过RNA干扰,细胞对MDR1耐药性明显下降,IC_(50)降低,细胞的耐药因子(RF)有所升高。结论siMDR1基因瞬时转染和稳定转染都可以抑制P-gp蛋白的表达,其可以作为基因治疗的重要手段。     

Cyclosporin A inhibits activation of inducible nitric oxide synthase in C6 glioma cell line

The effects of immunosuppressant cyclosporin A (CsA) on nitric oxide (NO) production and inducible NO synthase (iNOS) mRNA expression in rat C6 glioma cell line were investigated. CsA applied simultaneously with iNOS activator IFN-γ caused dose-dependent reduction of NO synthesis in confluent C6 cells, as determined by measuring accumulation of nitrite, an indicator of NO production, in 48 h culture supernatants. IFN-γ-induced expression of iNOS, but not interferon regulatory factor-1 (IRF-1) mRNA was reduced in CsA-treated cells. The enzymatic activity of iNOS was not changed by CsA, since it failed to affect NO production in cells in which iNOS had already been induced with IFN-γ and any further induction was blocked by protein synthesis inhibitor cycloheximide (CHX). FK506 was not able to mimic inhibitory effect of CsA on NO production in C6 cells, suggesting calcineurin-independent mechanism of CsA action.     

人CD80基因转染U251瘤株细胞的实验研究

目的 构建编码人CD80基因的真核表达载体，转染神经胶质瘤细胞株U251，并检测CD80基因在U251中的表达。方法 PCR法扩增人类CD80基因的开放阅读框（ORF）全长，酶切法连接入真核表达载体pcDNA3．1。构建为重组质粒pcDNA3．1／CD80，双酶切及测序鉴定。利用脂质体法将pcDNA3．1／CD80转染U251细胞株，应用RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学法、Western blotting等技术从细胞及分子水平检测人CD80分子在U251细胞表面的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3．1／CD80双酶切可切出约900bp目的片段。测序结果和NCBI检索CD80序列吻合；RT-PCR检测到pcDNA3．1／CD80转染后的U251细胞中CD80mRNA表达；荧光显微镜下观察可见大量免疫荧光标记的绿色荧光细胞，检测转染效率约31．8％；Western blotting可检测到约60kD蛋白条带。结论 本实验成功构建了pcDNA3．1／CD80真核表达载体，并实现了在神经胶质瘤细胞株U251中的表达，为后续研究CD80的表达对肿瘤细胞免疫原性的影响以及制备神经胶质瘤肿瘤疫苗提供了重要的实验材料。     

胶质瘤多药耐药细胞系C6／adr的建立及其耐药性逆转的研究

目的 研究胶质瘤多药耐药（ＭＤＲ）的发生机理及逆转方法。方法 建立了Ｃ６／ａｄｒ ＭＤＲ细胞系,经ＲＴ－ＰＣＲ及免疫组化染色分别研究了ｍｄｒ－１基因及Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）的表达;采用ＭＴＴ药敏试验及ＨＰＬＣＡ测定细胞内阿霉素浓度的方法研究了异搏定、红霉素、潘生丁、Ｐ－ｇｐ单克隆抗体、复方丹参对ＭＤＲ的逆转作用。结果 Ｃ６／ａｄｒ ＭＤＲ细胞系ｍｄｒ－１基因阳性,Ｐ－ｇｐ高度表达。异搏定（２～６μ     

Celecoxib诱导C6胶质瘤细胞凋亡的研究

目的探讨Celecoxib(塞来昔布)诱导C6胶质瘤细胞凋亡的作用。方法应用吖啶橙、透射电镜和流式细胞仪(FCM)检测方法。结果通过吖啶橙及电镜检查发现Celecoxib 50μmol／L组细胞凋亡明显多于12．5μmol／L组，FCM检测Celecoxib 50μmol／L组细胞凋亡为15．32％，12．5μmol／L组凋亡为5．83％，不同浓度的Celecoxib对C6胶质瘤细胞有增殖抑制及诱导凋亡的作用，凋亡随药物浓度增加而升高。结论Celecoxib对C6胶质瘤细胞呈剂量依赖性抑制及诱导凋亡的作用．对胶质瘤治疗有重要意义。