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相似文献
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1.
目的探讨帕金森病动物模型和细胞模型中α-突触核蛋白与Wnt/β-catenin信号通路的相关关系及其导致神经元损伤的可能机制。方法在动物水平和细胞水平上应用western blotting方法、流式细胞术、免疫荧光法等方法研究α-synuclein与Wnt/β-catenin信号通路关键信号分子GSK-3β的表达关系及其对细胞活性的影响。结果α-syn转基因小鼠脑组织中α-synuclein、p-GSK-3β蛋白表达量均明显增加,与对照组和MPTP组相比具有统计学差异(P 0. 05);α-syn过表达组SH-SY5Y细胞中α-synuclein、p-GSK-3β表达量较对照组及MPP+损伤组明显升高,结果具有统计学差异(P 0. 05);阿立哌唑预处理组α-synuclein较对照组及MPP+组明显增加,p-GSK-3β与对照组及MPP+组差异不具有统计学差异;阿立哌唑预处理组细胞活性明显高于α-syn过表达组,细胞凋亡率较α-syn过表达组明显下降,差异具有统计学意义(P 0. 05);免疫荧光法示α-synuclein与p-GSK-3β存在共定位关系。结论α-synuclein可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路导致神经元损伤,从而参与帕金森病的发病机制。  相似文献   

2.
目的观察苁蓉精水提物及苁蓉精纳米微粉对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导损伤的多巴胺能神经细胞MES23.5细胞中帕金森病相关蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、Tau蛋白表达的影响,探讨苁蓉精治疗帕金森病的作用机制。方法分别将苁蓉精水提物及纳米微粉经PBS溶解后加入培养基使终浓度为100、200、250μg/mL,孵育MPP+诱导的PD模型细胞24h后,并设模型对照(MPP+诱导的PD模型细胞,不加干预)及空白对照组(未经任何处理的MES23.5细胞),以MTT法检测细胞的存活率,Western Blot法测定各组细胞内α-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白表达。结果同空白对照组比较,模型组及苁蓉精水提物及纳米微粉100、200、250μg/mL组α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均升高(分别P0.01、P0.05);与模型组比较,苁蓉精水提物及纳米微粉100、200、250μg/mL组α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均显著降低(分别P0.01、P0.05)。除苁蓉精纳米微粉100μg/mL组GSK-3β磷酸化水平与苁蓉精水提物100μg/mL组比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各苁蓉精纳米微粉组α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均低于相同浓度的苁蓉精水提物组(分别P0.01、P0.05)。结论苁蓉精水提物及苁蓉精纳米微粉均能够减轻MPP+诱导的PD模型细胞的损伤,且苁蓉精纳米微粉的效果相对较好。其机制可能与苁蓉精可以减少α-synuclein的聚集,降低GSK-3β的活性,抑制Tau蛋白的过度磷酸化有关。  相似文献   

3.
目的通过比较过表达A53T(Ala53Thr)突变型α-突触核蛋白(α-synuclein)的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞与正常细胞的特性及对鱼藤酮引起细胞损伤的影响,探索α-synuclein在帕金森病发病机制中的作用,为寻找治疗药物潜在靶点提供依据。方法通过比较过表达A53T突变型α-synuclein的SH-SY5Y细胞与正常细胞的细胞形态及生长曲线观察突变型α-synuclein对细胞毒性的影响;用呼吸链抑制剂鱼藤酮刺激细胞,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法观察细胞的存活率,免疫印迹法观察自噬相关蛋白的变化。结果正常细胞形态上接近于梭形,过表达A53Tα-synuclein的细胞胞体变的肿胀,小的突起增多,甚至出现多种变异的形态;过表达A53Tα-synuclein的细胞生长较正常细胞缓慢,培养相同时间达到的细胞总数相对较少;4μM鱼藤酮处理两种细胞,过表达A53Tα-synuclein细胞损伤较正常细胞大,正常细胞随鱼藤酮处理时间的延长自噬相关蛋微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)的水平出现先下降后上升的趋势(P0.05),A53T细胞出现先上升后下降的趋势。结论过表达A53T突变型α-synuclein具有细胞毒性,且与正常细胞相比更容易受到损伤,可能与自噬敏感性增高,加速自噬耗竭相关。因此增加突变型α-synuclein的清除或增加自噬合成的相关蛋白诱导自噬可能会成为PD潜在的治疗靶点。  相似文献   

4.
目的探索Numb蛋白对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)寡泛素化水平的调控。方法分别将EGFP-N1或EGFP-Numb与HA-α-syn共同转染SH-SY5Y细胞;采用细胞免疫荧光法检测α-syn蛋白和Numb蛋白的亚细胞共定位;使用免疫共沉淀的方法检测Numb蛋白与α-syn蛋白的相互结合;利用Western blot检测Numb蛋白对α-syn蛋白寡泛素水平的调控;在MPP+细胞模型中利用细胞免疫荧光检测Numb对α-syn包涵体形成的影响。结果 Numb与α-syn在细胞质中存在亚细胞共定位;Numb蛋白上调α-syn寡泛素化水平;Numb蛋白通过上调α-syn寡泛素水平促进MPP+诱导α-syn阳性包涵体形成。结论 Numb蛋白上调α-syn蛋白寡泛素水平并促进α-syn包涵体形成。  相似文献   

5.
目的探讨鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞建立帕金森病(Parkinson disease,PD)细胞模型的方法。方法实验分为空白对照组及鱼藤酮0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L组共5组,各组分别于鱼藤酮加入24h、48h点,观察SH-SY5Y细胞形态变化,采用MTT比色法检测细胞活力;于24h时采用Western blot法检测细胞α-突触核蛋白(α-synuclein)表达量;对空白对照组及鱼藤酮0.5μmol/L、1.0μmol/L组于24h、48h行HE染色观察细胞内包涵体形成情况。以激光共聚焦免疫荧光法观察鱼藤酮1.0μmol/L组24h时α-synuclein的分布情况。结果空白对照组细胞生长较密,神经突起细长;在鱼藤酮药物组24时,0.5μmol/L组细胞突起变短,1.0μmol/L组细胞突起短缩更明显,2.5μmol/L组胞体肿胀明显,5.0μmol/L组圆缩细胞增多;各浓度组48h时与24h时比较,细胞突起变短、细胞肿胀、圆缩更明显。MTT试验显示1.0μmol/L鱼藤酮24h组和0.5μmol/L鱼藤酮48h组分别使细胞活性下降到空白对照组的(86.06±9.06)%和(62.06±7.13)%,与对照组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示鱼藤酮0.5、1.0、2.5和5.0μmol/L组SH-SY5Y细胞内α-synuclein相对表达水平分别为(1.23±0.11)、(1.41±0.20)、(1.77±0.09)和(1.31±0.28),其中1.0μmol/L、2.5μmol/L鱼藤酮组α-synuclein水平高于空白对照组(P0.05);HE染色显示,在1.0μmol/L鱼藤酮24h组和0.5μmol/L鱼藤酮48h组均观察到细胞质内出现嗜伊红、边界清楚的类路易小体样包涵体;免疫荧光染色显示在1.0μmol/L鱼藤酮24h组观察到细胞内出现颗粒状α-synuclein免疫染色阳性聚集体,可被Thioflavin S共定位。结论 1.0μmol/L鱼藤酮24h诱导SH-SY5Y细胞所建立的PD模型能够很好地模拟PD病理改变,可作为研究PD发病机制的细胞模型。  相似文献   

6.
目的探讨富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)干扰对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病(PD)细胞模型线粒体功能及CaMKK-β/AMPK通路的影响。方法采用MPP+诱导传代培养的SH-SY5Y细胞构建PD细胞模型。将造模的SH-SY5Y细胞随机分PD模型组、空载转染组(空载转染PD模型细胞)和siRNA转染组(siRNA-LRRK2转染PD模型),另设正常对照组,每组设3个复孔。采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞LRRK2 mRNA表达,采用免疫印迹(WB)法检测各组细胞LRRK2蛋白表达,采用JC-1探针法检测各组细胞线粒体膜电位,采用试剂盒检测各组细胞线粒体复合物I(Complex I)活性及ATP含量,采用WB检测各组细胞中CaMKK-β/AMPK通路相关蛋白CaMKK-β、AMPK和p-AMPK蛋白表达。结果与正常对照组相比,PD模型组LRRK2蛋白表达增加(P<0.05),线粒体膜电位下降,Complex I活性及ATP含量降低(P<0.05),CaMKK-β/AMPK通路蛋白CaMKK-β、AMPK、p-AMPKα(Thr 172)蛋白表达增加(P<0.05)。与PD模型组比较,siRNA转染组LRRK2 mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05),线粒体膜电位提升,Complex I活性及ATP含量增加(P<0.05),CaMKK-β、AMPK和p-AMPK蛋白表达降低(P<0.05)。结论LRRK2干扰可改善MPP+诱导的PD细胞模型中受损的线粒体功能,抑制CaMKK-β/AMPK信号通路。  相似文献   

7.
目的 应用蛋白质组学技术研究6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导SH-SY5Y细胞帕金森病(PD)模型中Peroxiredoxin6(Prx6)的表达变化.方法 在建立6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型的基础上,分别提取6-OHDA实验组和对照组孵育24h的细胞总蛋白,应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息,运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定出差异蛋白质.结果 DIGE分析发现实验组有一个表达明显上调的差异蛋白质点(P<0.01),经质谱分析鉴定确认为Prx6.结论 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞的帕金森病模型中Prx6表达上调,提示PD中有氧化应激存在,Prx6上调及氧化应激可能与PD的发病机制有关.  相似文献   

8.
目的探讨miR-133b对l-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病(PD)多巴胺能神经元模型中酪氨酸羟化酶(TH)表达量的影响。方法采用大鼠胚胎(孕14 d)中脑腹侧组织进行原代细胞培养,依据不同处理方法分为4组:1空白对照组,无任何干预措施;2阴性对照组,使用携带空载miRNA慢病毒颗粒(miR-NC)持续转染48 h,换液后无血清培养基继续培养24 h;3miR-NC+MPP+组,使用携带空载miRNA慢病毒颗粒持续转染48 h,换液后10μmol·L-1MPP+继续作用24 h;4miR-133b+MPP+组,使用携带miR-133b慢病毒颗粒持续转染48 h,换液后10μmol·L-1 MPP+继续作用24 h。采用Western blot法分别检测各组TH蛋白表达水平。结果与miR-NC+MPP+组比较,miR-133b+MPP+组TH蛋白表达量显著升高,差异有统计学意义(F=22.598,P0.05)。结论 miR-133b可提高PD多巴胺能神经元模型中TH蛋白表达水平,发挥一定的神经保护作用。  相似文献   

9.
目的 探讨1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)所诱导的自噬应激在嗜铬细胞瘤(PC12)细胞损伤中的作用以及MPP+导致α-突触核蛋白自噬性清除障碍及其异常聚集的可能机制.方法 在MPP+处理细胞24 h后,采用四甲基偶氮盐法检测细胞活力,Western blot检测α-突触核蛋白及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)在蛋白水平表达的变化,并用MDC染色和免疫荧光标记观察自噬水平的变化及α-突触核蛋白、LC3-Ⅱ和溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)在细胞内的共定位情况.结果 MPP+处理后细胞的活力明显下降;与未处理组相比(PC12组:0.20±0.08;A30P组:0.76±0.09),PC12+MPP+组(0.66±0.07,t=5.7271,P=0.0023)和A30P+MPP+组(1.71 4±0.40,t=8.6100,P=0.0005)α-突触核蛋白表达增加;LC3-Ⅱ蛋白的表达水平及自噬泡的平均数目均增高.另外,MPP+处理后,α-突触核蛋白和LC3-Ⅱ的荧光信号及其共定位增加,尽管LAMP-1标记的溶酶体荧光信号增加,但与LC3-Ⅱ标记的自噬体共定位程度却减小.结论 MPP+导致自噬体与溶酶体的融合出现障碍,引起α-突触核蛋白的自噬性清除障碍与自噬应激的出现,最终导致细胞的损伤甚至死亡.  相似文献   

10.
目的研究1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)对人骨髓神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞哺乳动物雷帕霉素靶位(mTOR)信号通路相关蛋白表达的影响。方法体外培养的SH-SY5Y细胞分为正常对照组、MPP+0.25 mmol/L组、0.5 mmol/L组及1 mmol/L组,各MPP+组细胞与含相应浓度的MPP+培养24 h。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞相对存活率;应用免疫印迹法检测各组细胞中mTOR蛋白、核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、mTOR调控相关蛋白(Raptor)、雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣蛋白(Rictor)以及与自噬相关的微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)、Beclin1蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,各MPP+组细胞相对存活率显著降低(P<0.05~0.001);mTOR、p70S6K、Raptor、Rictor表达明显降低(P<0.05~0.001);LC3Ⅱ和Beclin1表达显著升高(P<0.05~0.001),均呈现出明显的量效关系。结论 MPP+通过抑制细胞中mTOR信号通路,诱导SH-SY5Y细胞自噬性死亡,并且与MPP+的浓度相关;这可能是MPP+导致PD动物模型发病的机制。  相似文献   

11.
12.
目的 探讨黄芩苷是否通过上调长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)H19表达来减轻1-甲基4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导的PC12细胞神经毒性。方法 分别采用0.5、0.75、1、2 mmol/L MPP+和10、20、50和70 μmol/L黄芩苷作用PC12细胞,后续试验使用水平分别选择0.75 mmol/L MPP+和50 μmol/L黄芩苷; 以0.75 mmol/L MPP+损伤PC12细胞,体外模拟帕金森病,并加入黄芩苷; 采用四甲基偶氮唑盐(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)进行细胞活力测定,Annexin V-异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)双染法进行凋亡定量分析,蛋白质印迹分析(Western blot)检测Pro-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-3,Cleaved-caspase-3,B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)蛋白和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的相对表达水平,实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)进行lncRNA H19的相对表达水平检测; 在PC12细胞中转染lncRNA H19小干扰RNA(lncRNA H19 siRNA,si-H19),并加入MPP+和黄芩苷,考察PC12细胞增殖、凋亡等变化。结果 与对照组比较,MPP+降低PC12细胞的存活率、Bcl-2蛋白、lncRNA H19相对表达水平,提高PC12细胞的凋亡率、Cleaved-caspase-3,Bax蛋白相对表达水平(P<0.05),而Pro-caspase-3蛋白相对表达水平无明显变化(P>0.05)。与MPP+组比较,黄芩苷显著提高MPP+诱导的PC12细胞的存活率、Bcl-2蛋白、lncRNA H19相对表达水平,降低PC12细胞的凋亡率、Cleaved-caspase-3,Bax蛋白相对表达水平(P<0.05),而Pro-caspase-3蛋白相对表达水平无明显变化(P>0.05)。转染si-H19后黄芩苷和MPP+诱导的PC12细胞的存活率、Bcl-2蛋白相对表达水平降低,PC12细胞的凋亡率、Cleaved-caspase-3,Bax蛋白相对表达水平升高(P<0.05),而Pro-caspase-3蛋白相对表达水平无明显变化(P>0.05)。结论 黄芩苷上调lncRNA H19表达,提高MPP+诱导的PC12细胞活力和降低其凋亡,减轻MPP+诱导的PC12细胞神经毒性。  相似文献   

13.
目的 探讨姜黄素对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病细胞模型的影响及分子机制。方法 使用MPP+(5 mmol/L)处理MN9D细胞构建帕金森病细胞模型,记为MPP+组; 正常培养的细胞作为对照组; 细胞给予40 μmol/L姜黄素处理后再用MPP+处理记为MPP++姜黄素组; 将NORAD siRNA转染至细胞后分别用40 μmol/L姜黄素和MPP+处理记为MPP++姜黄素+si-NORAD组; 将NORAD siRNA和miR-543-3p inhibitor共转染细胞后分别用40 μmol/L姜黄素和MPP+处理记为MPP++姜黄素+si-NORAD+anti-miR-543-3p组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA NORAD和miR-543-3p表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡,双荧光素酶实验检测lncRNA NORAD和miR-543-3p的靶向关系。结果 与对照组比较,MPP+组MN9D细胞中lncRNA NORAD表达下调,miR-543-3p表达上调,细胞凋亡率升高, MDA水平明显升高,SOD水平明显降低; 与MPP+组比较,MPP++姜黄素组lncRNA NORAD表达上调,miR-543-3p表达下调,细胞凋亡率降低, MDA水平明显降低,SOD水平明显升高; lncRNA NORAD靶向负调控miR-543-3p的表达; 抑制lncRNA NORAD逆转了姜黄素对MN9D细胞凋亡和氧化应激的抑制作用; 抑制miR-543-3p逆转了lncRNA NORAD的作用。结论 姜黄素可抑制MPP+诱导的MN9D细胞凋亡和氧化应激,其机制可能与调控lncRNA NORAD/miR-543-3p通路有关。  相似文献   

14.
目的 研究甲状腺激素受体β1(TRβ1)和非典型脑膜瘤的关系及其作用。方法 通过real-timePCR和免疫组化分别对良性脑膜瘤和非典型脑膜瘤中的TRβ1进行检测;同时我们在体外进行原代脑膜瘤细胞培养,并通过MTT检测TRβ1对非典型脑膜瘤细胞的影响。结果 TRβ1mRNA在非典型脑膜瘤中的表达低于良性脑膜瘤,没有统计学意义(P>0.05);但TRβ1阳性细胞在非典型脑膜瘤为平均40.75个/mm2低于良性脑膜瘤93个/mm2,有统计学意义(P<0.05)。而在体外实验中,T3干预可有效抑制非典型脑膜瘤细胞的增殖,在浓度为20 ng/ml时MTT OD值由对照组0.24±0.028下降到0.17±0.008,抑制作用明显,具有统计学意义(P<0.05),而在siRNA沉默TRβ1蛋白的表达后,可有效减弱T3对细胞的抑制作用。结论 TRβ1在非典型脑膜瘤上的表达下降,在被其配体T3激活后可有效抑制非典型脑膜瘤细胞增殖。提示TRβ1可能在非典型脑膜瘤的发生及生长过程中扮演着重要角色。  相似文献   

15.
16.
目的探讨叶酸对小鼠HT22细胞拟帕金森(PD)损伤产生的影响。 方法将小鼠HT22细胞作为研究对象,随机分为对照组、模型组、叶酸组及治疗组4组。采用CCK-8、LDH、TUNEL以及免疫荧光试验检测叶酸对MPP+诱导的细胞损伤的活性影响以及NOD样受体蛋白3(NLRP3)荧光表达的影响;采用Western免疫印迹和qPCR实验检测叶酸对MPP+诱导细胞损伤后NLRP3、凋亡相关微粒蛋白(ASC)、Caspase-1表达的影响;利用ELISA检测叶酸对MPP+诱导细胞损伤后白细胞介素(IL)-18和IL-1β表达的影响;最后采用Western免疫印迹检测NLRP3抑制剂CY-09对MPP+诱导细胞损伤后ASC、Caspase-1、IL-18和IL-1β表达的影响。 结果MPP+诱导HT22细胞引起拟PD损伤,CCK-8、LDH、TUNEL实验检测结果显示叶酸可显著缓解损伤引起的细胞活性的降低和凋亡细胞的增加;免疫荧光试验检测结果显示叶酸可降低损伤后细胞中NLRP3荧光强度的升高;Western免疫印迹和qPCR试验检测结果显示叶酸可降低NLRP3、ASC、Caspase-1在蛋白水平和mRNA水平的升高;ELISA检测结果显示,叶酸治疗可显著缓解损伤后细胞内IL-18和IL-1β的分泌;最后采用Western免疫印迹检测显示CY-09可以阻断损伤后细胞内ASC、Caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白水平的升高。 结论叶酸通过降低IL-18和IL-1β表达保护MPP+致HT22细胞拟PD损伤,潜在的保护机制可能与NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路密切相关。  相似文献   

17.
目的观察脑膜瘤患者醛脱氢酶9家族成员A1(member of the aldehyde dehydrogenase 9 family A1,ALDH9 A1)、乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase,ALDH2)蛋白表达情况,并分析其临床意义。方法选取2015年8月-2017年5月在我院接受治疗的60例脑膜瘤患者为观察组,选取同期在我院接受治疗的脑外伤患者60例作为对照组,观察两组ALDH9 A1、ALDH2蛋白表达情况,比较两组血管内皮生长因子(VEGF-A)、基质金属蛋白酶(MMP-9)、胰岛素样生长因子-2(IGF-Ⅱ)及其受体(IGF-ⅡR)水平的差异,分析脑膜瘤患者ALDH9 A1、ALDH2蛋白表达情况与VEGF-A、MMP-9、IGF-Ⅱ和IGF-ⅡR水平的相关性。结果观察组患者的ALDH9 A1阳性和ALDH2阳性表达率均高于对照组(χ2值=70.533、86.724,P0.001);观察组患者的VEGF-A和MMP-9蛋白表达水平均高于对照组(t=-16.866、-15.162,P0.001);观察组患者的IGF-Ⅱ阳性和IGF-ⅡR阳性表达率均高于对照组(χ2值=101.538、112.258,P0.001);脑膜瘤患者的ALDH9 A1、ALDH2阳性表达率与VEGF-A、MMP-9水平和IGF-Ⅱ和IGF-ⅡR阳性表达率正相关(r=0.612、0.598、0.605、0.627、0.608、0.612、0.634、0.587,P0.05)。结论脑膜瘤患者的ALDH9 A1、ALDH2蛋白阳性表达率较高,且与EGF-A、MMP-9水平和IGF-Ⅱ和IGF-ⅡR阳性表达率明显正相关。  相似文献   

18.
目的探讨β-羟基丁酸(BHB)对SD大鼠神经元细胞缺氧损伤的保护作用及其机制。方法原代培养SD大鼠神经元细胞,不同浓度(2 m M、5 m M、10 m M、20 m M和50 m M)BHB预处理24 h,三气培养箱糖氧剥夺培养2 h,线粒体超氧化物探针检测细胞线粒体氧化应激状态,CCK8检测细胞活力变化,QPCR测Na+偶联单羧酸转运体1(SMCT1)、caspae3和Cytochrome C的m RNA表达,Western Blot测SMCT1、caspase3、细胞色素C(Cytochrome C)、ERK1/2和p-ERK1/2(T202/204)蛋白表达。结果 2 m M、5 m M和10 m M浓度BHB对神经元细胞活力无显著影响(P0.05),20 m M和50m M浓度BHB可致神经元活力显著降低(P0.05)。神经元缺氧培养后,活力降低(P0.05),线粒体氧化应激反应增强(P0.05),SMCT1的m RNA水平和蛋白水平显著降低(P0.05),caspase3与Cytochrome C的m RNA水平和蛋白水平明显增强(P0.05),ERK1/2的蛋白磷酸化水平降低(P0.05)。BHB预处理缺氧神经元,低浓度对细胞无明显影响(P0.05);浓度增至10 m M,相比单纯缺氧组,神经元活力显著改善(P0.05),线粒体氧化应激状态降低(P0.05),SMCT1的m RNA水平和蛋白水平显著增加(P0.05),caspase3与Cytochrome C的m RNA水平和蛋白水平明显降低(P0.05),ERK1/2的蛋白磷酸化水平升高(P0.05)。结论高浓度(20 m M)BHB对神经元细胞有毒性作用;低浓度(5 m M)BHB对糖氧剥夺的神经元细胞无明显作用;10 m M浓度的BHB预处理可增加SMCT1转运体的表达,通过启动ERK1/2信号通路,降低神经元线粒体的氧化应激,减少凋亡,从而对糖氧剥夺的原代神经元细胞发挥保护作用。  相似文献   

19.
目的 探讨微小RNA-146a(MicroRNA-146a,miR-146a)在缺血性脑卒中小胶质细胞/巨噬细胞极化中的作用及其潜在机制。方法 构建大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,脑内注射阴性对照物(Negative control mimic,NC mimic)或miR-146a mimic; 构建BV2小鼠小胶质细胞(BV2 mouse microglia,BV2)缺血缺氧(Oxygen glucose deprivation,OGD)模型,将NC mimic,miR-146a mimic转染至OGD处理的BV2细胞中,进行改良神经功能缺损评分(Modified neurological severity scores,mNSS)评估神经功能; 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色检测脑梗死体积; 实时荧光定量聚合酶链反应(Real time quantification polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测脑组织及细胞中的miR-146a、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)和精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg1)mRNA水平; 免疫荧光染色检测小胶质细胞M1/M2极化标志物; 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子κB(Nuclear transciption factor kappa B,NF-κB)通路蛋白的表达水平; 双荧光素酶报告基因检测miR-146a与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)的靶向关系。结果 与假手术(Sham)组比较,MCAO组大鼠脑组织中miR-146a表达水平显著降低,mNSS评分和脑梗死体积显著升高,CD16+Iba-1+细胞和CD206+Iba-1+细胞数量均增加,M1标志物MCP-1,iNOS和M2标志物IL-10,Arginase-1 mRNA水平均显著升高,而过表达miR-146a后mNSS评分和脑梗死体积显著降低,M1极化标志物水平降低,M2极化标志物水平升高(P<0.05)。与对照(Control)组比较,OGD组BV2小胶质细胞中的miR-146a表达水平显著降低,集群分化因子16(Cluster of differentiation 16,CD16)+离子钙接头蛋白分子-1(Ionized calcium bindingad aptormolecule-1,Iba-1)+和集群分化因子206(Cluster of differentiation 206,CD206)+Iba-1+细胞数量均增加,MCP-1,iNOS,IL-10和Arginase-1 mRNA水平均显著升高,TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达水平均显著升高; 与OGD+NC mimic组比较,OGD+miR-146a mimic组细胞中的miR-146a表达水平显著升高,M1极化标志物水平降低,M2极化标志物水平升高,TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论 miR-146a通过TLR4/NF-κB通路来促进缺血性脑卒中后M2极化,从而发挥神经保护作用。  相似文献   

20.
α-Synuclein is the key aggregating protein in Parkinson’s disease (PD), which is characterized by cytoplasmic protein inclusion bodies, termed Lewy bodies, thought to increase longevity of the host neuron by sequestering toxic soluble α-synuclein oligomers. Previous post-mortem studies have shown relative sparing of neurons in PD that are positive for the Ca2+ buffering protein, calbindin, and recent cell culture and in vitro studies have shown that α-synuclein aggregation can be induced by Ca2+. We hypothesized that depolarization with potassium resulting in raised Ca2+ in a PD cell culture model will lead to the formation of α-synuclein protein aggregates and that the intracellular Ca2+ buffer, BAPTA-AM, may suppress their formation. Live cell fluorescence microscopy was performed to monitor changes in intracellular free calcium in HEK293T, SH-SY5Y neuroblastoma or stably transfected HEK293T/α-synuclein cells. Raised intracellular free Ca2+ was consistently observed in cells treated with KCl, but not controls. Immunohistochemistry analysis on cells 48–72 h after K+ treatment revealed two subsets of cells with either large (>2 μm), perinuclear α-synuclein aggregates or multiple smaller (<2 μm), cytoplasmic accumulations. Cells pre-treated with varying concentrations of trimethadione (TMO), a calcium channel blocker, showed suppression of the Ca2+ transient following KCl treatment and no α-synuclein aggregates at TMO concentrations >5 μM. Quantitative analysis revealed a significant increase in the number of cells bearing α-synuclein cytoplasmic inclusions in both HEK293T/α-synuclein and SHSY-5Y cells when transient intracellular raised Ca2+ was induced (p = 0.001). BAPTA-AM pre-loading significantly suppressed α-synuclein aggregates (p = 0.001) and the intracellular free Ca2+ transient. This study indicates that raised intracellular Ca2+ mediated by K+ depolarization can lead to α-synuclein aggregation.  相似文献   

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