骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的　探索骨髓间充质干细胞 (MSCs)能否在体外诱导分化成神经样细胞 ,并初步探讨其分化机制。方法　培养大鼠MSCs,用二甲亚砜 (DMSO)和丁羟茴醚 (BHA)诱导分化 ,鉴定诱导分化前后的细胞是否表达神经细胞及神经干细胞的特异性标记蛋白 ,并研究其超微结构的变化。结果　诱导分化后 ,大部分MSCs变成双极、多极和锥形 ,并相互交织成网络结构 ,出现神经元特异性核蛋白 (NeuN)和巢蛋白 (Nestin)表达 ,无胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和 2 3 环核苷酸磷酸二脂酶 (CNP)表达。部分MSCs转变为典型的神经元超微结构。结论　MSCs可以在体外诱导分化为神经元样细胞。     

体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨体外培养的嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的影响。方法实验分为OECs MSCs共培养组和MSCs单独培养组,在7d和14d两时间点观察MSCs的分化情况。用p75抗体免疫细胞化学染色鉴定OECs细胞的纯度;用巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触后膜致密区蛋白(PSD)等抗体免疫细胞化学染色鉴定已分化的细胞表型。结果体外培养的MSCs经OECs诱导后分化为神经元样细胞,这些细胞能够表达NF、MAP2和PSD等神经元标记物,而不表达星形胶质细胞标记物GFAP。在培养7d,MSCs OECs7d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs7d组比较有明显增高。在培养14d,MSCs OECs14d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs14d组比较,也有明显增高。结论体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的体外研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSC)向神经元和多巴胺神经元分化的潜能。方法分离和纯化hMSCs;在体外以WHI-P131预处理和碱性成纤维细胞生长因子预诱导后,全反式维甲酸和胶质细胞源性神经营养因子联合诱导hMSCs向神经元和多巴胺神经元分化。光镜下观察其分化过程中hMSCs的形态变化,免疫组化检测诱导前后细胞是否表达神经元和多巴胺能神经元标志蛋白。结果诱导后的hMSCs能分化成为具有典型神经元形态的细胞,并明显表达抗人神经巢蛋白(nestin)[(54.2±3.7)%]和神经元特异性烯醇化酶(NSE)[(77.0±5.7)%],低表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)[(8.8±2.4)%];对照组细胞这些表达均为阴性;而且相当部分hMSCs表达酪氨酸羟化酶(TH)[(36.5±15.8)%]和多巴胺转运体(DAT)[(26.0±14.2)%]。结论在适当条件下,hMSCs可分化成为神经元样细胞和多巴胺神经元样细胞。     

创伤性脑组织匀浆对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响

目的：骨髓间充质干细胞在脑组织匀浆诱导环境下可以转化为神经元样细胞，损伤脑组织匀浆的骨髓间充质干细胞培养液中，不仅有脑组织中提取的生长因子，而且有骨髓间充质干细胞分泌的多种生长因子，共同刺激骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化。实验观察了创伤后24 h和正常脑组织匀浆诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的差别。 方法：实验于2007-03/08在河北医科大学解剖教研室细胞培养中心完成。①实验材料：体质量100~150 g的健康SD大鼠由河北医科大学实验动物中心提供，4~6周龄,清洁级。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取1只 SD大鼠，麻醉后分离股骨和胫骨，用培养基冲洗骨髓腔，离心弃上清液，加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基重悬，接种于培养瓶培养并传代，于倒置显微镜下观察细胞形态。采用Gruncr改良法制作中度脑损伤大鼠模型，取伤后 24 h和正常大鼠脑组织匀浆，对体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行诱导。③实验评估：在倒置显微镜下观察细胞形态学变化，并应用免疫细胞化学技术检测细胞内神经元特异性烯醇化酶的表达，比较创伤后和正常脑组织匀浆两组诱导率差别。 结果：骨髓间充质干细胞经创伤性脑组织匀浆培养基诱导24 h后，细胞的胞体变大，36 h后部分细胞分化，回缩成圆形或梭形，48 h后部分细胞可见两个或多个突起伸出，类似神经元。免疫细胞化学技术检测显示，创伤性脑组织匀浆培养基诱导组神经元特异性烯醇化酶阳性表达为（54.28±6.03）%，正常脑组织匀浆诱导分化率较前者低，神经元特异性烯醇化酶阳性表达为（32.76±3.25）%，细胞生长状态略差。 结论：脑组织匀浆可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，创伤性脑组织匀浆可明显促进其分化。     

碱性成纤维细胞生长因子等体外诱导成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外定向诱导分化为神经元样细胞。方法 采用Percoll分离液离心分离hMSCs，体外扩增，分别采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和2-巯基乙醇(2-ME)等无血清DMEM诱导hMSCs分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果 hMSCs在体外扩增传至5代后，流式细胞仪显示99．5％，97．8％，98．8％hMSCs表面抗原CD29、CD44、CD90表达阳性。接种到12孔板，3d后加入bFGF和2-ME联合或2-ME单种诱导剂诱导后，hMSCs胞体收缩，突起伸出；免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性，GFAP阴性。结论 成人骨髓间干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和分化为神经元样细胞的实验研究

目的体外分离和扩增小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并观察不同方法诱导BMSCs向神经元样细胞分化的差异,以寻找一种效果理想的BMSCs体外诱导方法。方法取昆明小鼠双股骨骨髓,采用全骨髓贴壁法体外纯化扩增BMSCs,流式细胞术检测其表面标志物,并对其进行成脂、成骨诱导鉴定。分别用化学诱导法和共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞,比较两种方法所获得的神经元样细胞的细胞形态。结果采用全骨髓贴壁法能有效分离小鼠BMSCs,随着传代次数的增加能得到逐渐纯化的BMSCs,而过多的传代次数则出现细胞生长速度缓慢、核固缩、脱离等衰老征象。流式细胞术检测结果显示P4代BMSCs阳性表达CD29和Sca-1,而阴性表达CD11b。具有成脂、成骨诱导分化的能力。共培养法诱导第5天可见神经细胞样形态且细胞突起数量较多并有分支;化学诱导法培养第7天细胞出现较长突起,形成神经样结构。结论采用全骨髓贴壁法能有效分离纯化小鼠BMSCs,通过共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞效果优于化学诱导法。     

神经节苷脂对骨髓间充质干细胞体外分化的神经元样细胞的影响

骨髓间充质不仅分泌多种因子，调节造血干细胞的增殖与分化，近年来研究表明，其还具有干细胞的特性，即自我复制和多向分化潜能，称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。在特定诱导条件下，MSC可以分化成多种组织细胞，可作为多种疾病细胞替代治疗和基因治疗的载     

骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后电生理特性的改变

背景：目前体外实验对骨髓间充质干细胞来源的神经元样细胞的研究多集中于形态学层面和神经标志物方面,对分化后的电生理功能研究较少。 目的：观察脑源性神经营养因子/碱性成纤维细胞生长因子/全反式维甲酸诱导Wistar大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后电生理特性的变化。 设计、时间及地点：细胞学体外培养,对比观察,于2005-06/2007-10在天津市环湖医院细胞室和南开大学生命科学院完成。 材料：6周龄雄性Wistar大鼠3只,体质量160 g左右。 方法：贴壁培养法体外分离纯化间充质干细胞,用脑源性神经营养因子/碱性成纤维细胞生长因子/全反式维甲酸联合诱导间充质干细胞向神经元样细胞分化。诱导前和诱导3 d后分别用膜片钳技术检测细胞膜电流。 主要观察指标：流式细胞仪检测间充质干细胞表型;倒置显微镜观察诱导分化前后细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定神经元特异性烯醇化酶的表达,以及全细胞电流测定结果。 结果：①流式细胞仪检测结果显示,CD90阳性率(99±3)%,CD31阳性率(3.4±0.8)%,CD34阳性率(0.3±0.1)%。说明这一细胞群大部分处于未分化的干细胞状态,其纯度可达95%。②光镜下可见未经诱导的间充质干细胞多为扁平形带突起的细胞,似纤维样细胞,诱导3 d后出现神经元样细胞。③免疫细胞化学结果显示,诱导前间充质干细胞的神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性,诱导后呈强阳性。诱导72 h时分化率为(24.01±3.76)%。④诱导组神经元样细胞外向电流峰值及最大外向电流密度高于对照组(P < 0.05),但未发现内向钠电流。 结论：脑源性神经营养因子/碱性成纤维细胞生长因子/全反式维甲酸诱导方法可以诱导间充质干细胞向神经元方向分化,虽未发现具有成熟神经元电生理功能,但有向成熟神经元分化的趋势。     

血府逐瘀注射液诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的最佳剂量筛选

背景：目前大量研究证明传统中药可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。 目的：观察中药血府逐瘀注射液对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找血府逐瘀注射液诱导分化的最佳浓度。 设计,时间及地点：细胞对照观察实验。实验于2009-07/2010-04在 广东医学院附属医院神经病学研究室及中心实验室完成。 材料： 4周龄SPF级SD雄大鼠,体质量约100g;血府逐瘀注射液的主要中药成分为红花、赤芍、川芎、丹参、当归。 方法：SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,3.00,5.00,10.00 g/L 4种剂量血府逐瘀注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较4种剂量血府逐瘀注射液诱导神经元样细胞抗原表达率。 主要观察指标：骨髓MSCs生长情况和形态观察,骨髓MSCs表面标志物的表达情况及诱导分化后神经细胞特异性标志物的表达。 结果与结论：①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞(96.18±1.65)% CD44表达阳性,CD45表达阴性。③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,3.00 g/L浓度组细胞的巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高。提示血府逐瘀注射液可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,3.00 g/L为最适诱导浓度。     

细胞密度与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

景：细胞种植密度是影响干细胞分化的因素之一,对于细胞种植密度在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用尚缺乏深入研究。 目的：观察细胞种植密度对骨髓间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的影响。 方法：采用贴壁培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代后将其按2×102,2×103,4×103,8×103,2×104,4×104/cm2种植于六孔板,每组均加入碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子+维甲酸诱导向神经元样细胞分化,并通过免疫组织化学染色鉴定,计算每组细胞出现神经元样细胞的比例,比较各组的分化率。 结果与结论：各组骨髓间充质干细胞加入诱导剂后均出现神经元样细胞,Nestin、NSE、GFAP细胞化学染色呈阳性。不同种植密度组出现神经元样细胞比例不同,以8×103/cm2组神经元样细胞比例最高,且神经元样存活时间最长,达7 d。结果说明骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化与细胞接种密度有关,过高或过低细胞密度均不利分化。     

bFGF和N2体外联合定向诱导骨髓间质干细胞向神经元样细胞分化

目的:将成年大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外定向诱导分化为神经元样细胞。方法:成年大鼠骨髓间质干细胞，进行体外扩增、纯化培养，对纯化后的MSCs，使用碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和神经培养添加剂N2进行诱导，使MSCs分化为神经元样细胞，并进行免疫细胞化学方法鉴定。结果：95．6％的MSCs出现形态改变，呈神经元样。免疫细胞化学法鉴定，显示神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)阳性表达。结论体外MSCs可以分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经元分化

目的　探讨大鼠中胚层来源的骨髓间充质干细胞(MSCs),在诱导因子的诱导下体外向神经元方向分化的能力。方法　贴壁法分离的MSCs,用NIM诱导,相差显微镜观察细胞形态变化,神经元特异抗体NeuN,MAP2,NSE免疫组化染色鉴定转化情况。结果　在诱导后30～40min即开始形态变化,形成神经元样的细胞,免疫组化染色神经元样细胞表达NeuN(50.83%±3.43%),NSE(59.83%±9.24%)和MAP2(45.17%±8.42%)。结论　MSCs在体外诱导下可以分化为神经元样的细胞,表明它是有别于一般成体干细胞的多能干细胞。     

全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 体外探讨全反式维甲酸（ATRA）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的作用。方法 从大鼠股髓分离出MSCs，采用贴壁法体外扩增、传代，取5代后细胞采用EGF共培养，二巯基乙醇（2-ME）预诱导，再以ATRA为诱导剂诱导，然后免疫细胞化学检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。结果 MSCs诱导后具有神经元样细胞的形态，免疫细胞化学显示nestin、NSE、AchE有阳性表达，而GFAP、TH表达为阴性。结论 ATRA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，且可表达AchE。     

成年大鼠骨髓间质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间质于细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性。方法 通过全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。应用流式细胞仪测定细胞周期,并研究其增殖及生长特征。结果 原代及传代培养显示,10代以前的MSCs具有活跃的增殖能力,细胞周期分析显示有168％的MS＆处于S＋G2／M期。MS＆细胞形态可呈梭形、圆形或椭圆形,经传代融合时呈漩涡状、菊花状排列。结论 体外培养10代以前的MSCs生长稳定,增殖较快,为进一步开展中枢神经系统疾病的移植治疗提供了细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞体外培养特性的初步观察

目的　观察人骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)在体外培养时的生物学特性。方法　应用密度梯度离心法将MSCs自骨髓中分离出来 ,利用其贴壁生长的特性加以纯化 ,在常规培养条件下观察其形态学及生长增殖特性。结果　从人骨髓中可分离得到间充质干细胞 ,流式细胞仪检测纯度较高。培养的MSCs呈成纤维细胞样 ,以克隆形式增殖 ,生长曲线示在对数生长期细胞群体倍增时间为 3 3h。结论　骨髓间充质干细胞可有效分离 ,体外培养表现出旺盛的增殖能力。     

依达拉奉体外定向诱导人间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：依达拉奉作为新型氧自由基清除剂,一般用于抑制脂质过氧化反应,减轻脑水肿,保护神经细胞。 目的：观察依达拉奉体外定向诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-12/2008-09广东医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓来源于创伤所致闭合性股骨骨折的成年患者,由广东医学院附属医院骨科提供。依达拉奉由南京先声药业生产,批号P2007123144254453。 方法：无菌抽取的骨髓经肝素化后,采用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离获得人骨髓间充质干细胞,传至第5代按1× 108 L-1接种于6孔板内,设立2组,依达拉奉组细胞达50%融合时用含碱性成纤维生长因子、胎牛血清的L-DMEM预诱导24 h,PBS洗涤后再用20 mg/L依达拉奉无血清L-DMEM诱导24 h;空白对照组始终用含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养,不加任何预诱导剂和诱导剂。 主要观察指标：诱导分化后细胞形态变化,SP法免疫细胞化学鉴定神经元烯醇化酶、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白2的表达。 结果：体外诱导1 h后,依达拉奉组胞体收缩,2 h后形成较长突起,5 h后呈典型神经元样细胞;空白对照组细胞仍呈对称的梭形,无突起形成。免疫组化结果显示,诱导6 h后依达拉奉组神经元样细胞的胞体及部分突起呈棕黄色,强表达神经元烯醇化酶,弱表达胶质纤维酸性蛋白和巢蛋白,不表达微管相关蛋白2;空白对照组上述4种特异性抗原均呈阴性表达。 结论：人骨髓间充质干细胞经依达拉奉体外诱导后,所分化的细胞具有神经元表型,但还不够成熟,处于向成熟神经元分化的中间阶段。     

底蜕膜间充质干细胞分化为多巴胺能样神经元

目的 探讨人胎盘底蜕膜间充质干细胞体外向多巴胺能样神经元分化的潜能,并优化诱导方案.方法 体外分离培养底蜕膜间充质干细胞,用表皮生长因子(EGF)+人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+ B27添加剂和人音猬因子(SHH)+成纤维细胞生长因子8(FGF8)+forskolin+脑源性神经营养因子(BDNF)分两个阶段对其进行诱导;免疫细胞化学先后检测干细胞标记nestin和CD133、成熟神经元标记神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质细胞标记胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、多巴胺能神经元标记酪氨酸羟化酶(TH)的表达;Western blot验证诱导后TH蛋白的表达;高效液相色谱-电化学检测诱导前后多巴胺的分泌.结果 经第一阶段诱导后,细胞形成漂浮生长的神经球,nestin和CD133均呈阳性表达;第二阶段诱导后,出现明显的神经元样形态,NSE、GFAP和TH均阳性表达,Western blot也显示TH蛋白的表达,多巴胺分泌量相比诱导前明显增加(P＜0.001).结论 底蜕膜间充质干细胞体外可分化为多巴胺能样神经元,可能成为帕金森病干细胞移植治疗新的种子细胞来源.