血管内皮生长因子基因修饰C17.2神经干细胞移植治疗脑梗死的实验研究

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）基因修饰神经干细胞（NSC）移植治疗脑梗死大鼠模型的治疗效果，以及基因的表达情况和神经保护作用。方法 通过移植腺病毒载体介导的VEGF165基因转染的C17-2NSC到大鼠大脑中动脉阻断（MCAO）的局灶性脑缺血模型脑梗死半暗带区，观察移植后大鼠神经功能变化，神经特异性烯醇化酶（NSE）、CD31免疫组化检查观察细胞存活分化和血管新生情况。结果 VEGF病毒组、NSC移植组和VEGF基因修饰NSC组神经功能严重度评分均较对照组显著减少（P〈0．05），以VEGF基因修饰NSC组最为显著（P〈0．05）；NSC移植后NSE阳性细胞数较对照组显著增多（P〈0．05），VEGF基因修饰NSC组更为碌著（P〈0．05）；VEGF病毒组和VEGF基因修饰NSC移植组脑梗死灶周围血管数较对照组显著增多（P〈0．05），以VEGF基因修饰NSC组更为显著（P〈0．05）。结论 转染VEGF基因的C17．2NSC脑内移植治疗MCAO脑梗死模型可促进NSC向神经元分化，可促进新生血管形成，改善神经功能。VEGF基因修饰NSC移植治疗效果优于单纯的C17．2NSC移植或VEGF基因治疗。     

核因子κB在低氧诱导因子1α基因修饰神经干细胞上调血管内皮生长因子表达中的桥接作用**

背景：很多研究发现,在脑缺氧损伤区域核因子κB与血管内皮生长因子表达呈正相关。因此,作者大胆假设,核因子κB是否处于低氧诱导因子1α上调血管内皮生长因子作用通路上并起桥接作用。 目的：以低氧诱导因子1α修饰的神经干细胞为载体,观察核因子κB 在低氧诱导因子1α上调血管内皮生长因子表达通路中的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/12在佳木斯大学神经科学研究所完成。 材料：新生24 h内的Wistar大鼠,雌雄不拘。 方法：扩增腺病毒载体低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白后转染神经干细胞,荧光检测神经干细胞中低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白及空载体Ad-绿色荧光蛋白表达,分别提取基因转染后神经干细胞、空载体转染神经干细胞、正常神经干细胞蛋白。然后低氧诱导因子1α基因修饰的神经干细胞中按50,150,300 μmol/L浓度梯度加入核因子κB特异性抑制剂二硫氨基甲酸酞吡咯烷,Western Blot法检测其中血管内皮生长因子的表达变化。 主要观察指标：各组神经干细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子和核因子κB 的表达;给予梯浓度核因子κB 特异性抑制剂后神经干细胞中血管内皮生长因子的表达。 结果：腺病毒低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白转染神经干细胞后基因表达强弱与MOI及转染时间有关;转染低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白后的神经干细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子和核因子κB的表达呈正相关;给予梯浓度核因子κB 特异性抑制剂后腺病毒低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白修饰的神经干细胞中血管内皮生长因子的表达呈抑制剂浓度依赖性下调,各浓度组之间血管内皮生长因子表达差异有显著性意义(P < 0.05~0.01)。 结论：核因子κB位于低氧诱导因子1α上调血管内皮生长因子表达的信号通路上并起桥接作用。     

诱导多能干细胞的研究

干细胞（stem cell）不仅可用于细胞分化、基因表达调控、胚胎发育等生物发育机制的研究,而且可应用于药物研制、细胞替代治疗和基因治疗等研究。一直以来都是生命科学领域的研究热点。根据细胞来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）通常指源自囊胚内细胞团的细胞,具有体外高度自我更新的能力并可被诱导分化为体内各种细胞类型。它们多取自人工流产的早期胎儿或是体外受精中剩余的胚胎,材料的不易获得影响了研究的开展。     

垂体瘤血管内皮生长因子表达及其意义

目的：探讨血管内皮生长因子在垂体瘤中的表达及其意义。方法：应用免疫组化法对20例复发、26例未复发的人脑垂体瘤中血管内皮生长因子表达进行检测。结果：复发组垂体瘤中血管内皮生长因子表达较未复发组明显增高,两组有显著性差异（P＜0．01）。结论：血管内皮生长因子在垂体瘤血管形成中起重要作用,可能与垂体瘤的发展与复发有关。     

转染血管内皮生长因子基因的人成骨细胞增殖及其生物学功能

背景：传统的自体或异体骨移植治疗骨缺损都存在难以克服的缺点,基因治疗可能是一种新途径。 目的：观察转染外源性血管内皮生长因子基因的人成骨细胞体外生物学特性。 设计、时间及地点：对比观察，细胞学实验，实验于2005-05/2006-05在辽宁医学院科学实验中心完成。 材料：人髂骨骨块取自需髂骨植骨的颈椎病患者的植骨块修洁剩余部分的骨质，患者知情同意。质粒pCDI/VEGF121为北京大学人类疾病治疗中心马大龙教授惠赠；感受态大肠杆菌DH5a为辽宁医学院刘丹平教授惠赠。 方法：体外分离和培养人成骨细胞。实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组。利用阳离子脂质体将pCDI-VEGF121真核表达质粒导入体外培养的人成骨细胞。 主要观察指标：传代后1，3，5，7 d观察血管内皮生长因子在人成骨细胞内的表达，及其对人成骨细胞增殖活力和细胞分泌骨钙素和碱性磷酸酶能力的影响。 结果：pCDI-VEGF121真核表达质粒转染人成骨细胞后第3，7天，以反转录聚合酶链反应方法检测到其中有血管内皮生长因子mRNA表达。转染组的细胞数在第1，3，5，7天均高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)。培养3 d时转染组成骨细胞的碱性磷酸酶阳性率大于对照组(P < 0.01)；转染组的骨钙素含量高于对照组(P < 0.05或< 0.01)。 结论：血管内皮生长因子基因转染可以促进体外培养人成骨细胞的增殖能力和相应的生物学功能。     

血管内皮生长因子165基因修饰人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质构建活性组织工程皮肤

背景：利用组织工程原理构建的人工皮肤替代物用于皮肤移植可有效解决供皮不足这一难题，但组织工程皮肤很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。 目的：以血管内皮生长因子165基因修饰的人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质，拟构建活性组织工程皮肤。 设计、时间和地点：以基因工程为基础的组织构建实验，于2008-03/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：普通级新西兰大白兔5只用于提取脱细胞真皮基质原料，由南昌大学医学院动物科学部提供，人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的患者，pShuttle-CMV/VEGF165质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。 方法：无菌条件下切取兔耳全层皮肤，将2 cm×2 cm皮片置于0.25%胰酶-EDTA消化液中去掉表皮，再置入曲拉通X-100溶液使真皮细胞完全脱净，磷酸盐缓冲液反复清洗，即为脱细胞真皮基质，4 ℃保存备用。采用密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，取传至第3代细胞，按5×105/孔密度接种，待细胞达80%融合时进行脂质体介导的pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染，接种于制备好的脱细胞真皮基质上体外联合培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质的形态观察，组织工程皮肤结构观察。 结果：体外培养的骨髓间充质干细胞大部分呈梭形，基因转染后细胞形态及活性无明显影响；脱细胞真皮基质呈瓷白色，柔韧有弹性。血管内皮生长因子165基因修饰的骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质共培养2 d后，所构建的组织工程皮肤呈淡红色，质软，接种细胞生长状态正常，苏木精-伊红染色及扫描电镜观察可见在脱细胞真皮基质的间隙中有大量长梭形细胞附着生长。 结论：血管内皮生长因子165基因转染的人骨髓间充质干细胞在兔脱细胞真皮基质中生长良好，可在体外联合构建活性组织工程皮肤。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P < 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

不同缺氧状态下骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的差异

背景：骨髓间充质干细胞在植入心肌缺血/梗死区域后，面临缺氧缺血微环境，其如何通过旁分泌细胞因子来发挥重建侧支微循环、修复心肌的作用，是目前存在争论的焦点之一。 目的：探讨骨髓间充质干细胞在不同时程缺氧环境下血管内皮生长因子的表达规律。 设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2008-03/11在南昌大学第二附属医院分子医学实验中心完成。 材料：清洁级新西兰大白兔2只，由南昌大学医学院实验动物中心提供。 方法：常规差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞。细胞缺氧微环境在AnaeroPack密闭方盒中产生，盒中置入一次性缺氧催化袋GENbox anaer(可吸收O2，产生CO2)，指示条监测氧的耗竭，根据缺氧培养时程分为缺氧0，6，12，24 h组。 主要观察指标：RT-PCR法检测血管内皮生长因子 mRNA的表达，Western Blot法检测血管内皮生长因子蛋白的表达。 结果：血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达水平均为缺氧0 h组< 6 h组< 12 h组< 24 h组(P < 0.01)。 结论：缺氧24 h以内的培养环境下，骨髓间充质干细胞表达血管内皮生长因子的水平呈缺氧时程依赖性增加。     

诱导多能干细胞与中枢神经系统疾病模型

重编程患者体细胞建立相关患者特异性诱导多能干细胞(iPS细胞)模型,对研究中枢神经系统疾病的发病机理、药物筛选及进一步自体移植治疗意义深刻.本文重点讨论了利用重编程技术建立脊髓性肌萎缩症、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、雷特综合征、精神分裂症等6种常见中枢神经系统疾病iPS细胞模型的最新进展,同时概述了该领域目前面临的问题.我们相信疾病特异性iPS细胞模型的建立,必将有助于中枢神经系统疾病的早期诊断及治疗.     

脑肿瘤血管内皮生长因子的研究进展

血管生成在生理及病理状态下均有重要意义,许多多肽生长因子或非肽因子参与血管形成;近年发现血管内皮生长因子(VEGF)与人脑肿瘤的发生、发展及治疗等关系密切。本文将对VEGF结构、生物学特性及其与脑肿瘤关系作一综述。1 VEGF及VEGF受体结构 1983年,Senger等从腹水和瘤细胞培养介质中纯化得到了一种具有促进体液和蛋白质从血管外渗的因子,称之为血管渗透因子(VPF);1989年Ferrara和Gospodarowicz等。又从正常垂体滤泡星     

诱导多能干细胞与神经退行性疾病

神经退行性疾病,包括帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症等的共同特征是在中枢神经系统的不同部位发生特发性神经元丢失.这些神经元的丢失给病人造成了一系列相应的功能障碍.应用人类胚胎干细胞进行细胞替代治疗曾引起人们很大的兴趣,但是一些伦理学问题阻碍了该研究的发展.通过导入特定的转录因子,体细胞能够被诱导为具有胚胎干细胞...     

人反义血管内皮生长因子基因载体构建及对肾细胞癌血管内皮生长因子表达的影响☆

目的： 构建反义血管内皮生长因子基因表达载体，观察其对肾癌细胞血管内皮生长因子表达的影响。 方法：实验于2006-07/2007-03在郑州大学第三附属医院实验中心完成。①实验材料：质粒 pcDNA3.1(－)，宿主菌DH5α，肾癌细胞株786-0。②实验过程：克隆人血管内皮生长因子基因，将反义血管内皮生长因子基因定向克隆于质粒pcDNA3.1(－)表达载体，酶切鉴定；转染人肾癌细胞，并分别命名为反义血管内皮生长因子组和空载体组，未转染细胞命名为对照组；G418筛选阳性克隆。③实验评估：反转录-聚合酶链反应方法检测血管内皮生长因子mRNA的表达，免疫组织化学法检测血管内皮生长因子基因的蛋白表达，流式细胞术检测细胞周期，四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长情况。 结果：①成功构建反义血管内皮生长因子基因表达载体。②反义血管内皮生长因子组血管内皮生长因子mRNA的表达受到抑制，明显低于空载体组和对照组血管内皮生长因子mRNA的表达(P < 0.01),空载体组血管内皮生长因子mRNA的表达没有受到影响。③反义血管内皮生长因子组的血管内皮生长因子蛋白表达明显降低，明显低于空载体组和对照组(P < 0.01)，空载体组和对照组血管内皮生长因子蛋白的表达差异无显著性。④反义血管内皮生长因子组细胞生长减慢，G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少,反义血管内皮生长因子组细胞生长明显减慢。 结论：成功构建血管内皮生长因子的pcDNA3.1(－)反义基因表达载体，人反义血管内皮生长因子基因可明显降低肾癌细胞血管内皮生长因子基因在转录和翻译水平的表达，抑制肾癌细胞生长，为肾癌基因治疗提供一定的实验依据。     

人骨髓CD34+干细胞分离培养及血管内皮生长因子165诱导分化的作用

背景：有研究证实，骨髓中CD34+干细胞在一定条件下具有向内皮细胞分化的潜能。 目的：体外分离、纯化、培养和扩增人CD34+造血干细胞，并检测其免疫学表型，观察血管内皮生长因子对其体外诱导分化后细胞免疫表型的变化。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。 材料：骨髓来源于健康供者。 方法：利用Percoll 梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离培养、扩增人骨髓CD34+干细胞。采用脂质体介导转染法，选生长良好的传代细胞，以血管内皮生长因子165 基因转染人骨髓CD34+干细胞。 主要观察指标：采用免疫荧光和流式细胞术检测人骨髓CD34+干细胞免疫学表型。经血管内皮生长因子165 基因转染后，人骨髓CD34+干细胞的表型变化以及血管内皮生长因子的分泌情况。 结果：体外分离培养出高度同源性的人骨髓CD34+干细胞，细胞形态呈成纤维细胞样。CD44、CD29和c-kit阳性，CD31和CD54阴性；经血管内皮生长因子165 诱导后，人骨髓CD34+干细胞表面标志CD44 表达降低，CD31升高，呈现典型的内皮细胞表型，并且获得大量分泌血管内皮生长因子的能力。 结论：采用Percoll分离液梯度离心继以贴壁筛选法及单克隆培养法联合筛选分离，可培养扩增出高度同源的CD34+干细胞，经血管内皮生长因子基因转染后，CD34+干细胞呈典型的内皮细胞表型，验证了其具有向内皮细胞分化的潜能。     

血管内皮生长因子与脑肿瘤

血管内皮因子(VEGF/VPF)/能够促进血管内皮细胞增殖和增加血管通透性,对肿瘤血管形成有强烈诱发作用。VEGF存在于多种动物和人的培养瘤细胞株、肿瘤组织和某些正常组织中,VEGFmRNA及其受体。mRNA在人类脑肿瘤中表达明显升高,与脑肿瘤的生长和转移有关,对VEGF深入研究对于脑肿瘤的诊治将会产生积极影响。     

人类诱导多能干细胞在帕金森病治疗中的研究进展

<正>帕金森病(PD)是继阿尔茨海默症(AD)后第二大常见的神经退行性疾病,多由脑内产生多巴胺的细胞受损或凋亡引起,好发于60岁以上的老年人,成为继肿瘤和心血管疾病之后威胁老年人身心健康的第三大杀手。据统计,目前全球约1000万老年人遭受PD的影响,每年对于该病的护理和治疗费用高达570亿美元,而这一数值还在持续上升。PD临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征~([1]),目前仍没有根治的治疗手段。近年来,干细胞如人类胚胎干细胞(hESCs)、骨髓间充质干细胞、多能干细胞(iPSCs)等等~([2]),为PD的研究和治疗带来了新的希望。干细胞不仅可利用神经退行性疾病的模型探索其发病机制并筛     

内皮抑素、血管内皮生长因子与脑梗死

内皮抑素(Endostatin)能特异性抑制血管内皮细胞的增生、迁移,并诱导其凋亡,从而抑制新生血管的形成;还可抑制斑块内膜血管生成从而抑制动脉粥样硬化斑块的生长。血管内皮生长因子(VEGF)可诱导内皮细胞增殖,促进新生血管形成。内皮抑素和VEGF作为血管形成的调节因子,可能与脑梗死的发生、发展及转归密切相关。     

诱导神经干细胞与诱导多能干细胞在同源宿主脑内的致瘤性及免疫原性研究

目的对比研究诱导神经干细胞（iNSCs）与诱导多能干细胞（iPSCs）在同源宿主脑内的致瘤性及免疫原性。 方法采用脑立体定向仪将1×10⁶个C57BL/6（B6）小鼠胚胎干细胞（ESCs）、iPSCs、神经干细胞（NSCs）及iNSCs分别移植到健康成年B6小鼠大脑运动皮层。于移植后14 d、28 d处死动物,取材进行形态学研究。 结果IPSCs和ESCs均可在小鼠脑内形成肿瘤导致组织坏死和免疫细胞浸润。然而,在iNSCs和NSCs移植组内,本研究未观察到肿瘤形成、脑损伤及免疫排斥反应。 结论INSCs移植物不具有致瘤性和免疫原性,因而较iPSCs移植物更安全。     

诱导多能干细胞应用研究进展

利用体细胞重编程技术将已分化的体细胞转化为诱导多能干(induced pluripotent stem,iPS)细胞是生命科学领域的一个里程碑事件。iPS细胞与胚胎干细胞的作用类似,均有分化成机体各种成熟细胞的潜能,但前者可以避免胚胎干细胞研究中存在的免疫排斥和医学伦理等问题。因此,iPS细胞在基础及临床研究领域均展现出良好的应用前景。本文对iPS细胞历经10年的研究历程、iPS细胞目前在临床各类疾病及药物监测中的应用以及iPS细胞研究中存在的问题进行综述,重点阐述iPS细胞在神经系统疾病中的应用。     

血管内皮生长因子和精神分裂症关系的研究进展

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是脑中血管生成和血流过程的主要因素,参与精神分裂症的发病机理.本综述的主要目的是总结和讨论这种营养因子在精神分裂症中的作用,提供精神分裂症患者VEGF的变化以及治疗如何影响VEGF的证据,讨论它们的局限性并提出进一步研究的...