尼古丁对Aβ25～35细胞毒性的拮抗作用及与β-淀粉样前体蛋白代谢的关系

目的研究尼古丁对β-淀粉样蛋白（Aβ）细胞毒性的拮抗作用及与β-淀粉样前体蛋白（APP）代谢之间的关系。方法不同浓度的尼古丁分别单独或与Aβ25～35同时作用于PC12细胞24h,然后采用MTT法检测细胞活力;WesternBlot法检测PC12细胞上清液中的可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段（sAPPα）和细胞内胰岛素降解酶的表达水平。结果（1）尼古丁浓度于0.10～500μmol/L时,对PC12细胞无明显毒性作用（均P〉0.05）,当浓度升至1000μmol/L时则产生一定的毒性作用（P≤0.05）;Aβ25～35浓度于1～100μmol/L时对PC12细胞具有明显毒性作用（均P≤0.01）,Aβ25～35浓度降至0.10μmol/L时则失去其毒性作用（P〉0.05）。（2）尼古丁浓度于0.10～1000μmol/L时,对Aβ25～35诱导的细胞毒性呈现不同的作用：尼古丁浓度于0.10～100μmol/L时可部分拮抗Aβ25～35诱导的细胞毒性作用（均P〈0.01）,但不能使PC12细胞活力恢复至正常细胞水平（均P〈0.01）;而当尼古丁浓度于500μmol/L和1000μmol/L时则不产生拮抗Aβ25～35诱导的细胞毒性作用（均P〉0.05）。（3）Aβ25～35（20μmol/L）和尼古丁（100μmol/L,1000μmol/L）单独或联合作用均可引起PC12细胞可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段分泌水平升高（均P〈0.01）,其中以尼古丁浓度为100μmol/L时可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段的分泌水平最高。（4）浓度为20μmol/L的Aβ25～35可导致胰岛素降解酶表达水平降低（P〈0.01）,而浓度为100μmol/L的尼古丁可明显拮抗这种作用（P〈0.01）,1000μmol/L的尼古丁则无明显拮抗作用（P〉0.05）;将浓度为100μmol/L和1000μmol/L的尼古丁分别单独作用于PC12细胞时,胰岛素降解酶表达水平明显升高,与正常对照组相比差异有统计学意义（P〈0.01）。结论尼古丁对Aβ25～35诱导的细胞毒性的拮抗作用与可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段的分泌水平并无直接关系,而可能与胰岛素降解酶的表达水平相关。     

稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白细胞模型的建立与鉴定

目的 建立和鉴定稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白(APP)的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞模型.方法 脂质体转染法将含人野生型APP751 cDNA的真核表达质粒pcDNA3/APP APP751WT转染至SH-SY5Y细胞,G418对转染后细胞进行筛选,获得稳定表达人野生型APP751细胞模型.Western blotting法、MTT比色法和放射免疫法检测细胞APP表达水平、细胞生长情况和细胞内外β-淀粉样蛋白(Aβ)表达水平.结果 转染组细胞APP表达水平明显高于未转染组和空载体组.未转染组和空载体组细胞滞留期为12 h,对数生长期为12 h-4 d;转染组细胞滞留期为24h,对数生长期为1～4d;培养12 h后,转染组细胞活力低于未转染组和空载体组(t=4.363,P=0.0012;t=4.040,P=0.003),培养1 d后,转染组细胞活力降低,且低于未转染组和空载体组(t=4.736,P=0.001;t=4.317,P=0.005),其余各时间点差异均无统计学意义(P>0.05).转染组细胞细胞外Ap表达水平高于未转染组和空载体组(t=7.690,P=0.000;t=7.448,P=0.000),而3组细胞细胞内A8表达水平则差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功建立稳定表达人野生型APP751的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞模型,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制提供了良好的细胞模型.     

线粒体相关性β淀粉样前体蛋白及线粒体相关性β淀粉样蛋白针对阿尔茨海默病致病机制的研究

线粒体相关性β淀粉样前体蛋白(APP)和线粒体相关性β淀粉样蛋白(Aβ)正逐渐成为研究阿尔茨海默病(AD)病理生理学改变的热点。线粒体相关性APP和线粒体相关性Aβ是指以线粒体为特异性靶点,存在于线粒体膜上或沉积于线粒体基质内的APP和Aβ。文中将分别介绍线粒体相关性APP和线粒体相关性Aβ的来源、结构、功能等方面的研究进展,揭示其与AD发病的密切关系。     

β-淀粉样蛋白前体降解产物对阿尔茨海默病致病作用的研究进展

阿尔茨海默病(AD)是以进行性记忆力减退和认知功能障碍为主要特征的老年期常见神经系统变性疾病.其特征性病理变化之一表现为细胞外以β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积为核心的神经炎性斑[NPs,又称老年斑(SPs)]形成.     

阿尔茨海默病患者血小板淀粉样前体蛋白代谢的改变

目的 通过观察血小板活化后β淀粉样蛋白(Aβ)水平变化,探讨阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者血小板β-淀粉样前体蛋白(APP)代谢特点.方法 分离36例AD患者和30名健康对照的血小板,用免疫印迹检测凝血酶作用后的可溶性APP水平;同时用放射免疫法测定Aβ含量.结果 凝血酶作用后,血小板上清中可以检测到可溶性APP和Aβ.活化后AD患者血小板上清中可溶性APP水平较对照组水平下降31.0%(P＜0.05).凝血酶活化后,AD组血小板上清Aβ水平从(3.1±2.7)ng/L增加至(5.8±3.2)ng/L(P＜0.01),对照组Aβ水平由(6.1±4.4)ng/L增加为(11.5±5.9)ng/L(P＜0.01).AD组Aβ平均增加(2.8±2.1)ng/L,低于对照组增加水平(5.5±3.6)ng/L(P＜0.01).结论 血小板中含有APP的代谢产物可溶性APP和Aβ.AD血小板可能存在APP代谢异常.     

降低细胞胆固醇水平对β-淀粉样肽生成的影响

目的观察降低细胞胆固醇水平对β-淀粉样肽(β-amyloid,Aβ)生成的影响,初步探讨胆固醇和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的相关性。方法以稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为模型,分别给予β-甲基环糊精或洛伐他汀对细胞系进行处理;胆固醇定量试剂盒测定细胞内胆固醇水平的变化,放射免疫法测定细胞培养液中Aβ的含量,Western Blot方法半定量检测全长型APP和可溶性APPα的水平。结果β-甲基环糊精和洛伐他汀处理组分别降低细胞胆固醇水平67.5%和49.5%(P<0.05),细胞培养液中Aβ含量分别降低39.5%和25.7%(P<0.05),sAPPα含量分别增加3.5倍和2.0倍(P<0.05)。结论降低细胞胆固醇水平使细胞外Aβ含量减少,sAPPα含量增加,这提示胆固醇可能通过影响APP代谢途径而参与AD的病理过程。     

β淀粉样蛋白及其前体在脑缺血性损伤中的机制研究进展

传统观念认为β淀粉样蛋白是阿尔茨海默病的主要致病物质，具有神经毒性，启动了阿尔茨海默病的病理过程。而近年来研究发现，它同时参与了脑缺血性损伤的过程。本文综述了β淀粉样蛋白在脑缺血性损伤中的机制。     

β-淀粉样蛋白前体蛋白胞内结构域(AICD)与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病的（Alzheimer＇s disease,AD）一个重要的病理学特征之一是脑内出现β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）组成的淀粉样斑。β-淀粉样蛋白前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶依次水解后产生Aβ和APP胞内结构域（APPintracellular do-main,AICD）。现在已经知道Aβ在AD的发病机制中起着关键作用,但是关于AICD的生理及病理功能还不清楚。近年来研究发现AICD可以与细胞内多种蛋白相互作用,而且AICD在基因转录、细胞凋亡,突触可塑性,神经发生以及APP的加工和运输过程中均有调节功能。本文针对AICD的生理及病理功能进行探讨。     

淀粉样前体蛋白胞内域的功能和机制

Alzheimer's disease (AD),a degenerative neurological disorder,is the most common form of dementia among older people,whose symptoms include gradual memory loss,cognitive impairments and deterioration of language skills.Amyloid precursor protein (APP) is cleaved by serials of secretases and generates Aβ,sAPPα/β and APP intracellular domain (AICD).Aβ forms amyloid plaques,together with neurofibrillary tangles (NFTs) which is comprised with hyperphosphorylated tau,are hallmarks ofAD.Aβ,especially in its oligomeric form,plays important roles in AD,causing cell death,calcium influx,loss of spines and repression of long-term potentiation (LTP)[1].However,recent studies indicate that in addition to Aβ,other fragments of APP after its cleavage,such as AICD,play essential roles in AD as well.In this article,the function of AICD and its underlying mechanisms will be reviewed.     

加兰他敏抗β淀粉样蛋白的神经保护机制研究

目的观察加兰他敏(Gal)对β淀粉样蛋白(Aβ)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)后β淀粉样前体蛋白(APP)代谢通路的影响,探讨Gal的神经保护机制。方法采用5μMAβ_(1-40)作用于SH-SY5Y细胞制备体外细胞损伤模型,0.3μM加兰他敏对Aβ_(1-40)处理的细胞进行干预并与正常细胞进行对照研究。倒置显微镜下观察细胞形态,应用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞活力,Western-blot技术定量检测各组APP,sAPPα,β-淀粉样前体蛋白剪切酶-1(BACE1)表达水平。结果 Aβ_(1-40)孵育细胞24h之后,细胞损伤明显,存活率从95.78.±2.5%降到62.93±2.1%,与对照组相比差异显著(P0.01);Western-blot显示细胞内BACE1表达增加,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα降低;在Aβ_(1-40)孵育之前给予加兰他敏作用24h,细胞损伤程度减轻,细胞的存活率上升(85.26±5.3%)(P0.01),细胞内BACE1表达较Aβ组下降,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα升高。结论加兰他敏通过抑制Aβ_(1-40)诱导的APP的异常代谢发挥神经保护作用。     

糖基化终末产物对人神经母细胞瘤细胞APP表达及Aβ生成的影响

目的通过研究糖基化终末产物（AGEs-BSA）以及阻断其与特异性受体RAGE的结合对培养的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）的表达以及β淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）生成的影响。方法以培养的SH-SY5Y细胞为模型,将细胞随机分为4组,空白对照组、BSA组、AGEs-BSA组、AGEs-BSA＋抗RAGE中和抗体组。用MTT法观察细胞形态以及确定AGEs-BSA的最佳干预时间及浓度。用免疫细胞化学方法及免疫印迹方法来检测各组细胞内APP、RAGE表达和Aβ生成情况。结果不同蛋白浓度的BSA处理细胞24、48、72h,与空白对照组比较细胞MTT代谢率,APP、RAGE及Aβ的表达水平没有明显差异,（P〉0.05）;不同蛋白浓度的AGEs-BSA（〉50μg/ml）处理细胞与BSA组比较,细胞MTT代谢率明显降低,并随蛋白浓度升高差异越明显,APP、RAGE、Aβ的表达水平较BSA组明显增加（P〈0.05）,预先用抗RAGE中和抗体（1∶100）1h后再加入AGEs-BSA,APP、Aβ的表达水平较AGEs-BSA组明显减少（P〈0.05）,但仍高于BSA组（P〈0.05）。结论糖基化终末产物能够促使SH-SY5Y细胞中APP、RAGE、Aβ的表达和生成增加。通过阻断其与特异性受体RAGE的结合可以部分减少APP、Aβ的表达和生成。     

阿尔茨海默病的淀粉样β蛋白前体基因的表达研究

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多光子激光扫描成像技术对活细胞内淀粉样前体蛋白裂解和β-淀粉样蛋白生成的观察

目的在活细胞内探究淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein,APP）的裂解和β-淀粉样蛋白（amyloidbeta,AB）的生成机制。方法利用PCR扩增CFP（编码蓝色荧光蛋白）,YFP（编码黄色荧光蛋白）和C99（编码APP最后99个氨基酸）三片段。含有54个碱基（编码APP中间18个氨基酸）的片段54bp由生物公司合成。CFP,YFP,54bp和C99四个片段连入载体质粒pcDNA3．0得到重组质粒pcDNA3．0-CFP-54bp-YFP和pcDNA3．0-CFP-54bp-YFP-C99。将这两个重组质粒分别瞬时转染SH-SY5Y细胞。利用多光子激光扫描显微镜观察融合基因的表达,荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）检测APP的B裂解。免疫细胞化学和多光子激光扫描显微镜观察AB的生成。MTT检测转染细胞活性。结果（1）限制性内切酶双酶切消化和测序分析鉴定重组质粒序列完全正确。（2）转染细胞内可以观察到蓝色和黄色荧光。（3）在pcDNA3．0-CFP-54bp-YFP转染细胞中存在FRET现象;在pcDNA3．0-CFP-54bp-YFP-C99转染细胞中观察不到FRET现象。（4）免疫细胞化学和多光子激光扫描显微镜观察到在pcDNA3．0-CFP．54bp-YFP—C99转染的细胞中有AD的生成。（5）AD的沉积广泛分布于细胞内。（6）随着AB在细胞内的产生和聚集,细胞的活性逐步下降。结论C99对于APP的β裂解非常重要。早期Aβ首先在细胞内生成并在细胞内形成广泛沉积。细胞内聚集的Aβ会影响细胞活性,带来不利结果。     

洛伐他汀对淀粉样前体蛋白β位点裂解酶表达和活性的影响

目的研究洛伐他汀对淀粉样前体蛋白β位点裂解酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE1)表达和活性的影响。方法予洛伐他汀对SH-SY5Y细胞系进行处理;通过噻唑蓝比色(MTT)法观察其对细胞活力的影响;采用酶法测定胆固醇含量,采用荧光光度法测定BACE1活性,采用WesternBlot方法检测BACE1蛋白的表达量。结果与对照组相比,5μmol/L洛伐他汀组作用24h后细胞胆固醇水平下降33.0%(胆固醇与总蛋白含量的比值:3.33vs.4.97;F=5.13,P=0.020),同时BACE1活性下降13.8%(343.14vs.398.22;F=3.773,P=0.035);5μmol/L洛伐他汀组作用48h后细胞胆固醇水平下降49.2%(胆固醇与总蛋白含量的比值:2.65vs.5.22;F=12.239,P=0.001),同时BACE1活性下降38.0%(274.75vs.443.14;F=13.610,P0.01);洛伐他汀组BACE1蛋白表达量与对照组相比无统计学差异(P0.05)。结论洛伐他汀不影响BACE1蛋白的表达,但可以抑制BACE1蛋白的活性,同时伴细胞胆固醇水平降低,这为阿尔茨海默病(Alzheimersdisease,AD)的防治提供了新的思路。     

血小板β-淀粉样肽前体蛋白免疫强度及异构体比率对Alzheimer病的诊断价值

目的 探讨血小板β淀粉样肽前体蛋白（APP）免疫强度及异构体比率对Alzheimer病（AD）的诊断价值。方法 应用流式细胞术和Western Blot方法分别检测31例AD患者、22例血管性痴呆（VD）患者、28例神经变性病患者及30名健康老年人血小板APP免疫强度和APP异构体比率。结果 APP免疫活性各组间差异无统计学意义;APP130／APP106比率AD组明显低于VD组、神经变性病组和健康老年组（均P〈0．05）;AD组APP130／APP、06比率与其简易智力状态量表（MMSE）评分呈正相关（r=0．607,P〈0．01）。结论 血小板APP异构体比率降低可用于临床对AD的诊断。     

多光子激光扫描成像技术对活细胞内淀粉样前体蛋白裂解和β-淀粉样蛋白生成的观察(英文)

目的在活细胞内探究淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的裂解和p一淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)的生成机制。方法利用PCR扩增CFP(编码蓝色荧光蛋白),YFP(编码黄色荧光蛋白)和C99(编码APP最后99个氨基酸)三片段。含有54个碱基(编码APP中间18个氨基酸)的片段54bp由生物公司合成。CFP,YFP,54bp和C99四个片段连入载体质粒pcDNA3.0得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP- C99。将这两个重组质粒分别瞬时转染SH-SY5Y细胞。利用多光子激光扫描显微镜观察融合基因的表达,荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测APP的β裂解。免疫细胞化学和多光了激光扫描显微镜观察Aβ的生成。MTT检测转染细胞活性。结果(1)限制性内切酶双酶切消化和测序分析鉴定重组质粒序列完全正确。(2)转染细胞内可以观察剑蓝色平和黄色荧光。(3)在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP转染细胞中存在FRET现象;在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99转染细胞中观察不到FRET现象。(4)免疫细胞化学和多光子激光扫描显微镜观察到在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99转染的细胞中有Aβ的牛成。(5)Aβ的沉积广泛分布于细胞内。(6)随着Aβ在细胞内的产生和聚集,细胞的活性逐步下降。结论C99对于APP的β裂解非常重要。早期Aβ首先在细胞内生成并在细胞内形成广泛沉秋。细咆内聚集的Aβ会影响细胞活性,带来不利结果。     

朊病毒蛋白样作用的β淀粉样蛋白

β淀粉样蛋白(Aβ)在阿尔茨海默病(AD)的发病中所起的作用至今尚不完全清楚。近年来的几项研究,提出Aβ可能与朊病毒蛋白类似,可以在脑组织中传播。首先,Aβ在物理化学性质及增值方式方面都与朊病毒蛋白类似。其次,通过外周途径或脑内注射的方式向动物模型注射外源性Aβ后,均可引起脑内Aβ沉积。最后细胞水平的实验直接证明了Aβ可以在细胞之间传递。     

中国早发性家族性阿尔茨海默病一家系淀粉样前体蛋白基因突变

目的 研究1个中国早发性家族性阿尔茨海默病(EOFAD)家系的临床表型及存在的基因突变.方法 收集1个EOFAD家系,分析2例患者的临床表现及辅助检查结果 .采集2例患者及其他家庭成员的血样,提取基因组DNA,采用直接测序法进行淀粉样前体蛋白(APP)基因第16、17外显子、早老素1基因和早老素2基因检测.结果 该家系中2例患者发病年龄较早,均缓慢起病,逐渐进展.首发症状为记忆力减退,Ⅱ3有发作性眨眼;Ⅱ5性格改变明显,病程中曾出现尿便障碍.2例患者的头部CT和MRI脑萎缩明显,以双侧颞叶为著.Ⅱ3的脑电图存在异常慢波.2例患者进行MMSE和蒙特利尔认知评估(MoCA)量表测试,提示为中重度智能减退.2例患者APP基因第17外显子中第2343位碱基发生突变(G→A),使编码APP的第715个密码子由GTG变为ATG,导致缬氨酸变为甲硫氨酸,发生V715M突变.Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅲ1ApoE基因型为ε4/ε4,Ⅱ9 ApoE基因型为e2/ε4.结论 该家系APP基因发生V715M突变,证实在中国人群存在这一突变现象,并且导致发病,提示对可疑阿尔茨海默病患者或家系进行基因检测时不要遗漏该突变位点.

Abstract：

Objective To analyze the phenotype and genatics in a Chinese family with early-onset familial Alzheimer's disease(EOFAD). Methods Peripheral blood were collected in available members in the family and genomic DNA was extracted. PCR-sequencing of exon 16 and exon 17 of the amyloid precursor protein(APP) gene, presenilin 1 (PSEN1), and presenilin 2 (PSEN2) was performed. Results At age 40, two EOFAD patients (siblings) in the family developed an insidious onset of difficulties in memory. One ( Ⅱ3 in the pedigree) showed blinking. The other ( Ⅱ 5 ) showed irritability and bradykinesia.Progressive diffuse coritcal atrophy in bilateral temporal cortex was observed. Moderate diffuse cerebral dysfunction was observed in Ⅱ3 by the electroencephalogram study and neuropsychological assessments.Sequencing revealed that both patients were heterozygous for a mutation c. 2343 G ＞ A in exon 17 of APP,causing the amino acid substitution Val715Met. Four members ( Ⅱ1, Ⅱ 3, Ⅱ 5 and Ⅲ1 ) were homozygous for ApoE ε4 allele. Ⅱ9 was ε2/ε4. Conclusions This study identified a mutation, Val715Met in the APP gene in Chinese patients with EOFAD. We suggest screening for APP gene mutations in Chinese patients with EOFAD.     

β-淀粉样蛋白代谢异常与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（AD）临床常见进行性认知功能下降,行为异常,最终出现痴呆。神经病理 可见 tau 蛋白神经纤维缠结、β-淀粉样蛋白（Aβ）蓄积形成老年斑,以及小胶质细胞增生和神经元、白 质、突触的大量缺失。由于淀粉样蛋白病理可能早于 tau 蛋白病理,早于 AD 脑萎缩及临床症状的出现, 现阐述 Aβ 代谢异常与 AD 的相关性。     

β分泌酶抑制剂对冈田酸诱导PC12细胞淀粉样蛋白前体蛋白代谢的影响

目的 探索β分泌酶抑制剂对冈田酸(OA)诱导的PC12细胞淀粉样蛋白前体蛋白(APP)代谢的影响. 方法 10 nmol/LOA作用4 h、8 h、16 h、24h及48 h诱导PC12细胞tau磷酸化,加β分泌酶抑制剂干预,MTT法测定细胞抑制率,免疫细胞化学法及Western blot检测全长APP和β-C末端片段(βCTF). 结果 10 nmol/L OA对PC12细胞的抑制作用呈时间依赖性,β分泌酶抑制剂可明显减轻该作用.OA诱导PC12细胞内全长APP和13CTF含量增加,B分泌酶抑制剂进一步增加细胞内全长APP含量,并减少βCTF含量. 结论 OA诱导PC12细胞中APP主要经β分泌酶途径代谢,生成具有神经毒性的βCTF.β分泌酶抑制剂通过维持细胞存活和减少13CTF从而减轻OA诱导的神经毒性,但使细胞内APP进一步增多.