听力学

20 0 4 0 6 42　　豚鼠柯替氏器支持细胞的分离和鉴定/肖自安… / /中国耳鼻咽喉颅底外科杂志 - 2 0 0 3,9(4 ) - 2 13～ 2 16　　目的 :建立豚鼠柯替氏器支持细胞的分离方法 ,并观察活性支持细胞的形态特征。方法 :对豚鼠基底膜用Ⅳ型胶原酶 (1mg/ml)消化和微机械分离法获得柯替氏器单离支持细胞 ,在倒置显微镜下观察细胞的活性和形态特征并记数。结果 :不同支持细胞在倒置显微镜下各有其形态特征 ,第一、二排Deiters细胞为逗点状 ,第三排为弓状 ;Hensen细胞为长圆形 ,半透明的胞质内含有数个脂质样颗粒 ;外柱细胞呈哑铃状 ,两端对称性…     

豚鼠耳蜗单离Deiters细胞分离方法及活性判定标准

目的 探讨分离单离Deiters细胞的方法及活性判定标准。方法 分别用胶原酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶消化基底膜后结合机械吹打分离出Deiters细胞，观察并计数。结果 单离的Deiters细胞呈豆点状，分胞体、柄、指突三部分，平均每双侧耳可分离到20－32个单离的Deiters细胞。活性标准：细胞膜光滑，双折射现象存在，细胞核位置正常，指突完整，无呈布朗运动的颗粒。结论 三种常用的酶孵育后结合吹打法均可以分离出相当数量且具有活性保存较好的单离Deiters细胞，标准可靠。     

豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的分离技术及其钾通道

目的　探讨适合膜片钳技术的单离Hensen细胞的分离及对其钾通道的研究。方法　取豚鼠耳蜗 ,获得Corti器 ,采用酶消化和机械分离方法对Hensen细胞进行分离 ,并采用传统全细胞膜片钳技术 ,记录单离Hensen细胞的钾电流。结果　每只耳蜗可以获得活性良好的单离Hensen细胞 12± 3个。Hensen细胞的钾电流呈明显的外向整流性 ,只有迟电流 (IK) ,没有峰电流 (IA)。结论　酶消化结合机械分离的方法可获得适用于膜片钳技术研究的单离Hensen细胞 ,并用于讨论了所记录到的Hensen细胞钾电流     

豚鼠耳蜗部分外支持细胞的分离法

目的 :探讨豚鼠耳蜗部分外支持细胞 (Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞 )的分离方法 ,并建立细胞活性的鉴别标准。方法 :选取健康杂色豚鼠 5只 ,解剖出耳蜗基底膜 ,采用酶解加机械吹打法分离Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞。结果 :可以获得较多数量、活性良好、长短不一的Deiter细胞和Hensen细胞 ,8h内细胞活性较好 ;但外柱细胞数量较少 ,存活时间较短。评价Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的活性标准 :①细胞膜无膨胀或扭曲 ;②细胞核无肿胀、移位 ;③在相差显微镜下细胞呈半透明状态 ,存在双折射现象 ;④细胞内无呈布朗运动的颗粒。结论 :熟悉耳蜗的解剖特性、分离出完整的基底膜 ,增加酶的浓度和加大机械吹打力度是获取活性良好的Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的关键 ;评价外毛细胞活性的 4项标准同样可用于判断Deiter细胞、Hensen细胞和外柱细胞的活性     

鼻粘膜纤毛细胞的分离及观察

目的为从细胞水平研究鼻粘膜纤毛上皮的生理功能，建立豚鼠鼻粘膜纤毛细胞的分离方法，提出单离纤毛细胞活性鉴定标准。方法利用木瓜蛋白酶消化及机械分离法分离出豚鼠鼻粘膜单个纤毛细胞，用配备相差或微分干涉相衬（ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｃｏｎｔｒａｓｔ，ＤＩＣ）装置的倒置显微镜在１００倍油镜下（总放大率１０００倍）观察。结果从每只豚鼠的鼻粘膜平均可分离出单离纤毛细胞（１２５８７±２４３７）个。活性良好的单离纤毛细胞的纤毛运动活跃，双折射性良好，质膜光滑，细胞无水肿或皱缩，可存活２～９ｈ以上。观察到纤毛呈来回摆动，具有快慢相，运动方向相同但不同步，运动速率为５１～１１９次／ｍｉｎ。结论本实验建立了豚鼠鼻粘膜纤毛细胞分离方法和单离纤毛细胞活性判断标准，观察了纤毛运动方式和频率。     

条件声暴露后豚鼠耳蜗外毛细胞丝束肌动蛋白表达的改变

目的：观察豚鼠耳蜗丝束肌动蛋白的表达及分布情况以及条件声暴露后耳蜗毛细胞丝束肌动蛋白的表达有无改变,初步探讨耳蜗“坚韧化”现象的发生机制。方法：实验用豚鼠分组后,采用中心频率为1kHz、强度为95dBSPL的倍频程噪声对动物进行条件声暴露。条件声暴露结束后按实验设计的时间处死动物并进行耳蜗铺片及免疫荧光染色。应用激光扫描共聚焦显微镜观察柯替器荧光染色情况并对1kHz频率感音区的第3回柯替器外毛细胞（OHC）的荧光强度进行定量分析。结果：豚鼠耳蜗柯替器丝束肌动蛋白主要分布在内外毛细胞的静纤毛、表皮板,OHC顶部细胞侧壁,柱细胞头板。在底回柯替器OHC基底部,Deiters细胞指突,外柱细胞的胞体亦含有丰富的丝束肌动蛋白。不同时期的条件声暴露后,除条件声暴露1d组加休息5d组外,其他2组动物OHC的荧光强度均有明显变化。结论：①一定剂量的条件声暴露可导致耳蜗柯替器丝束肌动蛋白表达的改变。②除内外毛细胞的静纤毛、表皮板,柱细胞头板等既往报道的部位外,豚鼠耳蜗柯替器的外柱细胞胞体中也含有丰富的丝束肌动蛋白。③条件声暴露后耳蜗OHC丝束肌动蛋白浓度的减低可能与耳蜗“坚韧化”现象的产生有关。     

鼻科学

990398鼻粘膜纤毛细胞的分离及观察/苏振伦…//中华耳鼻咽喉科杂志一1998,33(4)一203一205 目的:为从细胞水平研究鼻粘膜纤毛上皮的生理功能,建立豚鼠鼻粘膜纤毛细胞的分离方法,提出单离纤毛细胞活性鉴定标准。方法:利用木瓜蛋白酶消化及机械分离法分离出豚鼠鼻粘膜单个纤毛细胞,用配备相差或微分干涉相衬(differential interferenee eontrast·DIC)装置的倒置显微镜在100倍油镜下(总放大率100。倍)观察。结果:从每只豚鼠的鼻.粘膜平均可分离出单离纤毛细胞(12587士2437)个。活性良好的单离纤毛细胞的纤毛运动活跃,双折射性良好,质膜光滑,…     

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和支持细胞钾电流的影响

目的 观察KCNQ家族钾通道特异性阻滞剂利诺吡啶(linopirdine)对豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞(支持细胞)总钾电流的影响，初步探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的分布。方法 运用膜片钳技术，在全细胞模式下记录正常细胞外液中8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流，并观察100μmol／L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果 在正常细胞外液中，单离外毛细胞可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流(the K^ current activated at negative potential，IKn)两种钾电流，而单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。加入100μmol／L利诺吡啶后，外毛细胞中的四乙基二乙胺敏感的钾电流减小，IKn被完全抑制；而Deiters细胞中的外向整流性钾电流大小无变化。结论 KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞，其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分，并构成全部的IKn；但KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Deiters细胞。     

豚鼠耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的同时分离法

目的：探讨豚鼠耳蜗外毛细胞（OHC）和Deiters细胞（DC）同时分离的方法。方法：选健康杂色豚鼠，解剖出耳蜗基底膜，采用酶消化后机械分离。结果：可以同时获得一定数量，活性良好，长短不一的OHC和DC。结论：熟悉耳蜗的解剖特性，保持Corti器的完整及掌握机械吹打的力度是同时获取活性良好的OHC和DC的关键。     

单离豚鼠内耳Deiters细胞的形态及电生理特性

目的：分离豚鼠内耳活性良好的单离Ｄｅｉｔｅｒｓ细胞,观察其形态,探讨该细胞的基本电生理特性。方法：采用酶孵育加机械分离法分离Ｄｅｉｔｅｒｓ细胞;利用膜电钳技术在全细胞模式下检举同细胞电容,记录在正常外液中的钾电流,零电流电位,反转电位,并根据相应公式计算离子通道Ｋ与Ｎａ＾＋的相对通透性比率及Ｋ平衡电位（ＥＫ）《结果：单离Ｄｅｉｔｅｒｓ细胞多呈逗点状,分为胞体,细柄和指突三部分,核靠近胞体中央,平均     

Calpain在卡铂引起的耳蜗Ⅰ型传入神经系统损害中的作用

目的 研究观察Calpain在灰鼠耳蜗内的定位及其注射卡铂后不同时间的表现。方法 应用免疫细胞化学方法在透射电镜下观察卡铂引起的耳蜗毛细胞及其传入神经系统中Calpain的活动变化。结果 发现卡铂首先损坏耳蜗I型传入神经的树突并伴有Calpain的破坏活动。结论 卡铂引起的耳蜗I型传入神经系统的早期破坏可能是由于细胞内形成的高钙浓度激活了Calpain的活性，早此导致了I型传入神经原的蛋白质水解变性。     

丁胺卡那霉素诱发豚鼠耳蜗外毛细胞凋亡的实验研究

目的 探讨氨基糖苷类抗生素作用于耳蜗时外毛细胞凋亡现象及其凋亡发生特点。方法 用一定剂量的丁胺卡那霉素对15只豚鼠行耳蜗造模后利用光镜、TUNEL标记技术（teminal-deoxynucl eotidy transferase mediated d-UTP nick-end labeling)原位检测凋亡发生。结果 肌注丁胺卡那霉素1d后即可诱发豚鼠蜗底转外毛细胞发生凋亡,随着用药时间延长,其余各转外毛细胞亦发生凋亡,甚至出现部分外毛细胞丢失现象。结论 氨基糖苷类抗生素作用于耳蜗系统时可引起外毛细胞凋亡,细胞凋亡是豚鼠耳蜗听毛细胞损伤的一条途径;氨基糖苷类抗生素耳毒性作用机制可能与其引起耳蜗毛细胞凋亡有关。     

鼻咽癌病人放射治疗前后天然杀伤细胞活性、白细胞介素-2水平改变的研究

目的：探讨鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)病人放射治疗前后天然杀伤细胞(NK细胞)活性、白细胞介素—2(IL-2)水平的变化和肿瘤复发转移的关系。方法：选择139例首诊的NPC病人为NPC组，45例健康成人为对照组，两组间性别及年龄无显著差异。NPC病人根据肿瘤有无复发转移又分为两组，均予以^60Coγ射线外照射DT68—80Gy，分别检测放疗前和放疗后(36个月内)及对照组的NK细胞活性及IL-2水平，观察肿瘤复发转移的情况。结果：鼻咽癌病人放疗前、后0-30个月内NK细胞活性及IL-2水平动态观察均明显低于正常对照组(P＜0．05)，至放疗30个月后NK细胞活性及IL-2水平恢复近正常水平。肿瘤复发转移者其NK细胞活性及IL-2水平明显低于无复发转移者(P＜0．05)。30个月内肿瘤复发转移率为85．7％(60/70)。结论：NPC病人免疫功能状况与肿瘤复发转移关系密切。动态观察和评价NK细胞活性及IL-2水平对判断NPC是否复发和转移有一定的指导意义。     

Genotypic analysis of tumor suppressor genes PTEN/MMAC1 and p53 in head and neck squamous cell carcinomas

Objectives: Tumor suppressor gene mutations in both p53 and PTEN/MMAC1 genomic DNA have been detected in many types of cancer. The purpose of this study was to investigate the presence and importance of PTEN/MMAC1 mutations in squamous cell carcinomas. Methods: Exons of each gene were amplified after polymerase chain reaction (PCR) using genomic DNA derived from cell lines of squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN) and snap-frozen biopsy specimens from primary established head and neck tumors. The amplified and purified DNA was then sequenced directly. Result: As anticipated, point mutations of the p53 gene were found in 80% of cell lines examined. A single base mutation in codon 151 was found in six of 10 cell lines studied. PTEN/MMAC1 gene mutations were found in neither the cell lines tested nor the tumor biopsy samples. Conclusion: This study, as well as a large volume of data, confirms that mutations of the p53 gene are frequent events in head and neck cancer cell lines. Although PTEN/MMAC1 gene mutations have been found in a variety of carcinomas, this gene was not found to be mutated in SCCHN cell lines or in primary squamous cell carcinomas of the head and neck. This information is useful for further studies of mutations in these cell lines. Laryngoscope, 108:1553–1556, 1998     

Degranulation of mast cells provokes a massive inflammatory reaction in the tympanic membrane

OBJECTIVE: The pars flaccida is extremely rich in mast cells. On stimulation the mast cells release preformed and de novo synthesized inflammatory substances. The purpose of this study was to examine how these mast cell substances provoke inflammatory changes in the tympanic membrane. STUDY DESIGN: In vivo, murine model. METHODS: In a rat model, the mast cell secretagogue compound 48/80 was applied locally to the tympanic membrane on 4 consecutive days and the ensuing inflammatory changes were evaluated by otological, light, and electron microscopy 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, and 48 hours and 4, 6, and 8 days later. RESULTS: Degranulation of the mast cells occurred within 3 hours of applying compound 48/80. Release of the mast cell substances coincided with an inflammatory event characterized by a two-stage reaction: an edema stage, peaking 6 hours after application, followed by a massive invasion of inflammatory cells, peaking at 24 and 48 hours. Pars flaccida and pars tensa were both involved, pars flaccida showing the earliest changes. Pars tensa exhibited the same biphasic reaction as pars flaccida, but approximately 6 hours later. CONCLUSIONS: The mast cells of the pars flaccida have the capacity to elicit an intense inflammation of the tympanic membrane. The biphasic reaction pattern resembles that observed in experimental otitis media, suggesting involvement of the mast cells in this inflammatory condition of the middle ear.     

淋巴细胞在慢性鼻-鼻窦炎组织中的表达及意义

目的：探讨B淋巴细胞（CD20）和T淋巴细胞亚群（CD4、CD8）在慢性鼻-鼻窦炎（CRs）中的表达及在炎症反应中的作用。方法：采用免疫组织化学技术检测B淋巴细胞（CD20）和辅助性T细胞（CD4）、细胞毒性T细胞（CD8）在实验组[分为15例CRS不伴鼻息肉（CRSsNP）组、12例CRS伴鼻息肉（CRSwNP）组、7例复发性CRSwNP组]和对照组（13例下鼻甲黏膜对照）中的表达。采用Mann-WhitneyU检验分析实验组和对照组B淋巴细胞、T淋巴细胞亚群的表达情况,实验组组间淋巴细胞浸润比较用单因素方差分析One—WayANOVA。结果：与对照组相比,实验组有明届的13淋巴细胞（CD20）和T淋巴细胞亚群（CD4、CD8）浸润（P〈0．05）：T淋巴细胞、亚群（CD4、CD8）在CRSwNP组和复发性CRSwNP组病变中的表达明显高于CRSsNP组（P〈0．05）;CD4在复发性CRSwNP组中的表达明显高于CRSwNP和CRSsNP组（P〈0．01）。结论：实验组鼻腔黏膜中B淋巴细胞、辅助性T细胞和细胞毒性T细胞高表达,均参与炎症的形成,其炎症匣应与T淋巴细胞浸润密切相关。     

Airway stem cells: review of potential impact on understanding of upper airway diseases

Epithelial remodeling is a part of our natural defense mechanisms, and includes migration, proliferation, and differentiation of epithelial cells, as well as the interactions between epithelial and stromal cells. It is not yet possible to distinguish between cause and effect during epithelium remodeling, and are there no clear roles for the many factors involved in respiratory infectious and inflammatory diseases due to a lack of critical information about epithelial cell responses. Most reported data are from lower airway studies or animal models. Therefore, research based on human nasal epithelial stem/progenitor cells can illuminate the pathophysiology of nasal airway disease from a different, more specific perspective. In this review, we discuss epithelial stem/progenitor cell research throughout the airway, with special attention to phenotypes and characterization of these cells from the nasal airway. Recently, we have isolated and cultured P63-positive human epithelial stem/progenitor cells from turbinate biopsies of healthy volunteers and from inflamed mucosa of patients with chronic rhinosinusitis with and without nasal polyposis. These cells propagate in serum-free, growth factor-supplemented, Dulbecco's modified Eagle's medium/F12 media, on either human fibroblast or 3T3 feeder layers. Self-renewal, proliferation, and differentiation potential at an air-liquid interface are being investigated to understand the molecular pathways underlying nasal inflammation. This in vitro culture system for nasal epithelial regeneration will allow molecular studies of human nasal epithelial cell interactions, differentiation, and repair, as well as responses to both environmental agents and to potential anti-inflammatory treatments.     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin反义RNA表达载体,从基因水平靶向封闭Survivin功能,为探讨喉癌细胞凋亡和增殖的影响奠定基础。方法将Survivin大部分编码序列cDNA片段反向插入pEGFPC1载体,构建Survivin反义RNA表达载体。用脂质体转染技术将重组质粒转染人喉癌细胞株Hep2,并利用G418(300mg/ml的维持浓度)筛选,获得稳定细胞株(命名为HpEGFP/Survivin)。用蛋白免疫印迹Westernblot从蛋白质水平检测反义SurvivinRNA封闭Survivin的表达效果。结果构建的Survivin反义RNA表达载体(命名为pEGFP/Survivin),经酶切电泳和测序证实碱基序列的正确性。蛋白免疫印迹Westernblot结果表明,构建的Survivin反义RNA表达载体转染人喉癌细胞株Hep2,从蛋白水平抑制了Survivin的表达,抑制率为30%。说明反义SurvivinRNA载体构建成功。结论构建的Survivin反义RNA表达载体从蛋白水平抑制了Survivin的表达,可以进一步用于抑制Survivin基因表达的实验研究。     

鸡内耳盖膜的超微结构观察

为了解鸟纲内耳盖膜的超微结构及其与毛细胞、支持细胞的关系，应用扫描电镜和透射电镜对鸡内耳盖膜的超微结构进行观察。发现：扫描电镜下盖膜横断面呈三角形，内有许多空洞，内淋巴面呈网状；透射电镜下见盖膜由微丝及肢状基质构成，听毛细胞的最高排静纤毛及动纤毛插入盖腹中，支持细胞的微绒毛通过絮状细丝与盖膜呈锚状连接。这种连接既有弹性又十分牢固，可在一定范围内限制盖膜运动。由此推测鸟纲内耳与哺乳纲内耳在感受声刺激的方式上有所不同。     

建立稳定表达融合自杀基因CD／UPRT．UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株

目的：建立稳定表达融合自杀基因CD／UPRT．UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株。方法：构建表达载体pcDNA3．1（一）E6．BARFlP．cD／UPRT．UL49,经脂质体法转染CNE-2细胞,G418和前体药物5-氟胞嘧啶筛选出阳性克隆细胞并扩大培养。抽提阳性克隆细胞总蛋白质,Western-blotting检测目的基因表达。结果：融合自杀基因CD／UPRT．UL49在CNE2转染细胞内稳定表达。结论：本组通过脂质体转染技术,成功地建立了稳定表达融合CD／UPRT．UL49基因的CNE-2细胞株。