复制缺陷型腺病毒为载体的Math1基因内耳应用安全性研究

目的研究以复制缺陷型腺病毒为载体的Math1基因内耳应用的安全性。方法将10只成年Wistar大鼠分为正常对照组和缺失E1、E3基因片段且构建有Math1基因和绿色荧光蛋白报告基因的复制缺陷型腺病毒（adenovirus-Math1-enhanced green fluorescence protein,Ad-Math1-EGFP）前庭阶导入组（实验组）,每组5只,实验组大鼠在右耳通过耳蜗底回前庭阶打孔的方法导入物理滴度为2.1×1011v.p/ml的上述腺病毒5μl,对照组大鼠不做任何处理。7天后对动物进行颈髓硬膜外短声诱发电位（click-evoked potentials on the surface of the cervical dura mater,CDM-CEP）、听性脑干反应（ABR）阈值检测和游泳试验,评价前庭和耳蜗功能,然后将动物处死进行组织形态学观察。结果Ad-Math1-EGFP导入7天后,实验组大鼠前庭及耳蜗的毛细胞及纤毛均未见破坏,形态正常。短声刺激下,对照组大鼠CDM-CEP的阈值为85±3.54dBSPL,ABR阈值为37±4.47dBSPL;实验组大鼠CDM-CEP的阈值为89±6.52dBSPL,ABR阈值为40±3.54dBSPL;对照组大鼠的游泳时间为4.0±0.71s,实验组为5.0±0.71s,两组之间比较差异均无统计学意义。结论携带Math1基因的复制缺陷型腺病毒对前庭和耳蜗毛细胞是安全的,可以作为基因导入的理想载体。     

电离辐射对听功能影响的实验研究

目的观察电离辐射对豚鼠听功能的影响。方法将15只健康豚鼠随机分成两组：单纯放射组（简称单放组）10只,对照组5只,每组观察10耳。用直线加速器所产生的6MeV电子线对单放组豚鼠的耳颞部予以分次放射（2Gy/天）,总剂量达到60Gy;两组豚鼠实验前后行ABR检测,并通过光镜观察两组豚鼠实验后耳蜗毛细胞计数及形态学变化。结果放射后单放组豚鼠ABR平均阈值为52.27±2.42dBSPL,较实验前（22.50±3.12dBSPL）及对照组（21.00±3.57dBSPL）明显升高（P〈0.05）;耳蜗基底膜铺片光镜观察见对照组耳蜗内外毛细胞排列整齐,无缺如;单放组耳蜗外毛细胞有大量缺如,内毛细胞有少许缺如;外毛细胞计数：正常对照组为162.95±5.96个/视野,实验后单放组为54.75±7.71个/视野,其差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论分割剂量60Gy对豚鼠耳颞部放射可造成其听功能损害。     

腺病毒携带EGFP基因经完整圆窗膜转导豚鼠耳蜗的实验研究

目的研究腺病毒携带目的基因经完整圆窗膜途径耳蜗转导的可行性及安全性，为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法20只白色红目豚鼠，术前及术后分别行听性脑干反应（ABR）检查。实验组（12只）以重组腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白基因（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），对照组（8只）以人工外淋巴液注入豚鼠圆窗龛内。分别于术后5天、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片，耳蜗冰冻切片观察。结果于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因的转导方法对听力无明显影响。转染耳蜗及对侧耳蜗内目的基因呈广泛表达。5天组表达产物最高，14天组逐渐降低。对照组耳蜗未见EPFP表达。结论于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因转导的方法对耳蜗无明显毒害作用，且能够将目的基因成功转导至双侧耳蜗组织并广泛表达。     

腹侧听泡外入路小鼠耳蜗鼓阶基因导入的实验研究

目的研究腺病毒携带目的基因经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的可行性及目的基因的表达特点,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法16只健康5周龄C57BL/6J小鼠,腺病毒组10只,以重组腺病毒携带有Hath-1和增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP）,人工外淋巴液组6只以人工外淋巴液,经腹侧听泡外入路导入耳蜗鼓阶底转。分别于术后第7天分别行听性脑干反应（ABR）检查后取双侧耳蜗标本做基底膜铺片、耳蜗冰冻切片观察基因的表达。结果经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的转导方法对听力影响较小。腺病毒组耳蜗内目的基因呈广泛表达。对照组耳蜗未见荧光表达。结论经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的转导方法对听力影响较小,且能够将目的基因成功转导至耳蜗组织并广泛表达。     

二甲基亚砜对在体耳蜗毛细胞的毒性作用

目的研究二甲基亚砜(DMSO)对在体耳蜗毛细胞的毒性作用。方法取清洁级健康、ABR阈值正常SD大鼠32只,雌雄不限,体重100-120g。随机分成4组,人工外淋巴液对照组(即0%组)8只;0.1%DMSO溶液组8只;1%DMSO溶液组8只;5%DMSO溶液组8只。所有动物均取右耳作为实验耳。通过耳蜗鼓阶打孔显微注射向每个实验耳注入不同浓度DMSO溶液4ul。术前1天和术后7天分别进行ABR(click和toneburst)检测。激光共聚焦显微镜观察DMSO溶液导入7天后的毛细胞变化。结果人工外淋巴液对照组click、4kHz、8kHz、16kHz处阈移平均值均<5dBSPL,仅于32kHz处有约13dBSPL的阈移,形态方面未见明显损伤;0.1%浓度组在click、4kHz、8kHz处阈移平均值均<5dBSPL,而32kHz处阈移约25dBSPL,与人工外淋巴液对照组比较提示有统计学意义,激光共聚焦显微镜观察底回时偶见少数内毛细胞胀大;1%浓度即可引起OHC大量丢失,造成相应纤毛表皮板缺如,且以底回最重,各频率ABR阈移均>15dBSPL,32kHz处阈移>30dBSPL;当浓度增加到5%时,不仅损伤耳蜗底回的外毛细胞,也导致内毛细胞的丢失,所造成的听力损失在32kHz处较1%组严重。结论 DMSO对毛细胞的损伤存在剂量依赖性,损伤程度自耳蜗底回向顶回逐渐减轻。     

耳后入路圆窗膜显微注射小鼠耳蜗基因转染新途径的研究

目的研究腺病毒携带目的基因经小鼠耳后人路圆窗膜显微注射途径耳蜗转导的可行性,为以小鼠作为动物模型的内耳基因治疗提供实验基础和解剖学依据。方法12只C57BL／6J小鼠分为2组,实验组（8只）以重组腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP）、对照组（4只）以人工外淋巴液经耳后入路圆窗膜显微注射注入耳蜗内。分别于术后5、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片,在激光共聚焦显微镜下观察GFP表达。结果术后动物存活10只（每组死亡1只）。实验组转染后耳蜗底回基底膜及螺旋神经节上目的基因有表达,14天组强于5天组。对照组耳蜗未见荧光表达。结论耳后入路操作简单、损伤小、易于暴露圆窗龛。耳后入路圆窗膜显微注射腺病毒携带目的基因转导的方法能够将目的基因成功转导至耳蜗组织并表达。     

Math1基因内耳导入径路的探索研究

目的研究腺病毒携带Math1-EGFP基因经完整圆窗膜途径及鼓阶打孔途径导入耳蜗后对听功能和转导效率的影响,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法健康成年白色红目豚鼠40只,雌雄不限,体重250—300g。随机分成四组,完整圆窗膜组12只,鼓阶打孔组12只,各组分别设对照8只。实验组（24只）导入重组腺病毒携带的Math1基因及增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP）,对照组（16只）导入人工外淋巴液,所有动物均以左耳作为导入耳。术前及术后分别行听性脑干反应（ABR）检查。分别于术后5天、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片观察基因表达情况。结果完整圆窗膜组导入耳ABR阈值,术后5天各频率与术前比较无显著性差异（P〉0．05）;鼓阶打孔组导入耳ABR阈值,术后5天在2kHz、4kHz与术前比较无差异（P〉0．05）,8kHz较术前增高（P〈0．05）,16kHz、20kHz较术前明显增高（P〈0．01）,术后14天在16kHz、20kHz较术后5天时明显好转（P〈0．01）,但较术前仍有增高（P〈0．05）。转导成功率鼓阶打孔组为91．6％,优于完整圆窗膜组的50％。两种转导途径对目的基因在耳蜗内的表达部位和表达时间没有显著影响。结论完整圆窗膜途径及鼓阶打孔途径在转导成功率及听功能保护方面各有优劣。完整圆窗膜途径因其对耳蜗的损伤极小,在临床应用方面具有更好的发展前景。     

NGB基因转染拮抗庆大霉素耳毒性作用的实验研究

目的验证阳离子脂质体介导脑红蛋白(neuroglobin,NGB)基因转染对庆大霉素致豚鼠耳毒性的保护作用。方法将ABR反应阈均不超过40dB SPL的120只健康花色豚鼠随机分为5组,每组24只:Ⅰ组:空白对照组;Ⅱ组:人工外淋巴液对照组(经左耳注入人工外淋巴液);Ⅲ组:人工外淋巴液实验组(经左耳注入人工外淋巴液后肌肉注射庆大霉素);Ⅳ组:空质粒转染组(经左耳注入空质粒pEGFP-C1后肌肉注射庆大霉素);Ⅴ组:NGB基因转染组(经左耳注入pEGFP-NGB后肌肉注射庆大霉素),庆大霉素均经后腿肌肉注射120mg.kg-1.d-1,共给药14天。停止给药后喂养14天,各组均行ABR检测,耳蜗基底膜铺片、免疫组化观察各组豚鼠耳蜗基底膜毛细胞形态学及NGB蛋白表达的变化。结果给药后Ⅰ组ABR反应阈平均为37.22dB SPL(左耳)和36.94dB SPL(右耳),Ⅱ组阈值平均为37.22dB SPL(左耳)和37.50dB SPL(右耳),Ⅲ组阈值平均为119.44dB SPL(左耳)和122.22dB SPL(右耳);Ⅳ组阈值平均为119.72dB SPL(左耳)和120.83dB SPL(右耳);Ⅴ组阈值平均为83.89dB SPL(左耳)和100.56dB SPL(右耳)。Ⅴ组ABR反应阈较Ⅰ组和Ⅱ组显著升高(P<0.05),较Ⅲ组和Ⅳ组显著降低(P<0.05)。Ⅴ组中手术耳ABR反应阈较非手术耳降低(P<0.05)。耳蜗基底膜铺片示Ⅰ组和Ⅱ组内外毛细胞排列整齐,无缺失,Ⅲ组和Ⅳ组内外毛细胞极少量残存,其中ABR阈值大于135dB SPL的豚鼠耳蜗毛细胞几乎消失殆尽,Ⅴ组毛细胞部分缺失,且主要是外毛细胞;免疫组织化学染色示Ⅴ组耳蜗毛细胞NGB蛋白表达量较其余各组均显著增高(P<0.05),其余各组几乎均未见明显阳性表达。结论本研究成功验证了阳离子脂质体介导NGB基因转染对庆大霉素致豚鼠耳毒性具有有效的保护作用。     

Math1基因内耳导入后噪声性聋豚鼠听功能改变观察

目的观察Math1基因内耳导入对噪声性聋豚鼠听功能的影响,探讨Math1基因过表达对噪声损伤耳蜗的生物学效应,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法经脉冲噪声致聋的豚鼠45只（各频率ABR阈值均≥95dB SPL）,雌雄不限,实验开始时体草250～300g。随机分为3组：Ad—Math1-EGFP组（30只）;Ad—EGFP组（5只）;空白组（10只）。各组豚鼠在基因转导后4周、8周分别测试双耳ABR。测试完毕后处死动物,观察听泡及耳蜗尤炎性病变者记录听阈结果。结果Math1导入后4周,导入耳各频率ABR阈值低于对照耳（右耳）,也低于Ad—EGFP组及空内组,平均达到85dBSPL。Math1导入后8周,导入耳各频率ABR阂值低于对照耳（右耳）,也低于Ad—EGFP组及空白组,与4周时比较,进一步好转,平均达到75dB SPL。结论Math1基因内耳导入可使噪声导致全聋的豚鼠听功能部分恢复,为噪声性聋的治疗打开了新的思路和手段。     

气导和骨导ABR在先天性外耳道闭锁小儿听力评估中的应用

目的研究先天性外耳道闭锁小儿气导和骨导短声诱发的听性脑干反应（auditory brain stem response,ABR）的特点,评价骨导ABR的应用价值。方法将受试者分为两组。组1（闭锁组）为16例（21耳）先天性外耳道闭锁患者,年龄在1～13岁之间,平均为5．62岁;组2（对照组）为正常听力小儿15例（25耳）。年龄在1～13岁之间,平均为6．1岁。比较两组气、骨导ABR的特点。结果闭锁组气、骨导ABR反应阈值分别为（73．81&#177;7．4）dBnHL和（6．19&#177;4．98）dBnHL,正常组分别为（23．20&#177;4．76）dBnHL和（5．60&#177;5．07）dBnHL。30dBnHL刺激强度下闭锁组骨导ABR潜伏期与对照组相比差异无显著性。闭锁组气、骨导ABR阈值差值与正常组相比差异有显著性。结论骨导ABR可以用于评估先天性外耳道闭锁患者的耳蜗功能。