PM2.5暴露对慢性鼻窦炎患者鼻黏膜上皮细胞影响的转录组学分析

目的　研究PM2.5暴露对慢性鼻窦炎患者鼻黏膜上皮细胞（human nasal epithelial cells,HNECs）基因表达的影响,并探讨可能作用的机制。方法　6例慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者的HNECs气液交界培养后分为对照组（PBS处理）和PM2.5组（100 μg/ml PM2.5处理）,干预24h后提取各组细胞RNA进行转录组学测序（RNA sequencing,RNAseq）,筛选差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）并进行基因本体论（gene ontology,GO）及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes andgenomes,KEGG）富集分析,采用实时荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR,RT-PCR）检测关键基因（CYP1A1、CYP1B1）的表达。结果　RNA-seq表明PM2.5组与对照组相比DEGs共279个,其中上调表达76个,下调表达203个,CYP1A1和CYP1B1是排名前两位的上调DEGs,而下调DEGs主要与DNA复制和蛋白质合成相关。通过GO和KEGG富集分析发现DEGs主要参与应激反应、氧结合、脂类物质代谢等,其中细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）酶起重要作用。RT-PCR结果显示,PM2.5组CYP1A1、CYP1B1表达量显著上调（P<0.05）,这与RNA-seq测序结果一致。结论　PM2.5可能通过调控CYP450酶中相关基因的表达,影响脂类物质代谢诱导HNECs氧化应激和促炎反应。     

人鼻黏膜上皮细胞的原代培养及传代

目的探讨人鼻黏膜上皮细胞的原代培养及传代方法。方法取鼻内镜下行鼻中隔手术时切除的正常下鼻甲黏膜。以DMEM/F12培养基及Keratinocyte SFM（K SFM）培基先后培养及传代,同时培养鼻咽上皮细胞NP69作参照。于倒置显微镜下进行细胞形态学观察,以台盼蓝染色观察细胞活力,免疫细胞化学进行上皮细胞鉴定。结果鼻黏膜上皮细胞呈鹅卵石样生长,传代后形态一致性提高,细胞活力达88.1%,纯度达92.97%,免疫组织化学证实为上皮细胞。结论此方法培养的鼻黏膜上皮细胞活力及纯度高,并可进行一定程度的传代,是获得人鼻黏膜上皮细胞的一种有效方法。     

人鼻黏膜上皮细胞2种原代体外培养方案的比较研究

目的:比较人鼻黏膜上皮细胞(HNE)2种常用的体外培养方法的效果,探索适宜的HNE体外培养方案。方法:比较组织块培养方案和分离细胞培养方案的HNE体外培养成功率和生长曲线,进行HNE的形态学观察和细胞来源鉴定,以初步了解其生物学特性。结果:分离细胞培养方案的体外培养成功率(87.50%)优于组织块培养方案(83.33%),但差异无统计学意义(P>0.05)。分离细胞培养方案的HNE生长曲线较高于组织块培养方案。2种体外培养方案的HNE经细胞形态学观察和细胞角蛋白染色均证实为上皮细胞来源。结论:分离细胞培养方案细胞混杂少,增殖迅速,HNE获取稳定、可靠,较适宜原代培养研究。     

酶消化分离法原代培养人鼻黏膜上皮细胞的改进

目的：探讨酶消化分离法原代培养人鼻黏膜上皮细胞的实验步骤和技术要点，以提高原代培养成功率，为后续实验提供良好的培养模型。方法：在酶消化分离细胞、无血清培养法的基础上，对取材处理、消化酶应用等步骤进行改进，如翻揭分离获取黏膜层、消化中加入I型DNA酶（DNase type I）、胶原酶消化后含黏膜块的溶液中直接加入胰蛋白酶，以及应用不包被的培养皿培养等。原代培养的鼻黏膜上皮细胞经免疫荧光染色细胞角蛋白（CK）8／18进行鉴定。结果：鼻黏膜原代培养细胞生长良好，6-8d汇合可用于后续实验。CK8／18免疫荧光染色阳性鉴定为上皮源性细胞。结论：酶消化分离细胞、无血清培养法可成功建立人鼻黏膜上皮细胞原代培养模型，对取材处理、酶消化等步骤进行上述改进，可提高原代培养成功率，并获得一定数量级，以及纯度较高和可靠的原代上皮细胞。     

呼吸道合胞病毒感染对慢性鼻窦炎伴鼻息肉上皮屏障功能的影响

目的 为探索呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）感染对慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）和对照黏膜来源的人鼻黏膜上皮细胞（human nasal epithelial cells,hNECs）物理屏障关键分子的影响。方法 不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）(0.1和0.3)的RSV分别感染鼻息肉（n=21）和对照黏膜（n=9）的hNECs 24 h和48 h后,提取总RNA,逆转录成cDNA后,采用实时荧光定量PCR检测ZO-1、ZO-2、Claudin-1、Claudin-4、Occludin、E-cadherin和N-cadherin的基因表达变化。结果 RSV感染hNECs后,ZO-1、ZO-2、Claudin-1、Claudin-4、Occludin、E-cadherin和N-cadherin的基因表达水平均下降,但只在鼻息肉来源的hNECs中存在统计学差异（P<0.05）。RSV感染嗜酸性粒细胞型CRSwNP(eosinophilic CRSwNP,ECRSwNP)与非嗜酸性粒细胞型CR...     

PM2.5暴露对人类咽部微生态的影响

目的　探讨PM2.5对人类咽部微生态的影响。方法　选择2016年12月～2017年3月我院冬季雾霾严重时就医的咽炎患者和非咽炎患者做咽部微生物的检测,2017年6～9月非雾霾环境下的咽炎患者和非咽炎患者做咽部微生物的检测。结果　暴露PM2.5环境下的咽炎患者咽部正常菌种检出率明显降低（P <0.05）,条件致病菌检出率明显增加（P <0.05）。结论　PM2.5可以破坏咽部微生态平衡,导致正常菌群种类及数量减少,致病菌易于定植,破坏咽部黏膜正常结构,导致咽炎发生,并且损伤程度随着PM2.5日均值浓度及暴露时间的增加而加重。     

低温等离子射频消融下鼻甲对鼻黏膜功能的影响

目的观察低温等离子射频治疗慢性肥厚性鼻炎对鼻黏膜传输功能的影响。方法应用糖精试验法测定60例(A组)慢性肥厚性鼻炎患者低温等离子射频术前及术后3、6个月的鼻腔黏膜纤毛输送率(MTR),并与45例微波治疗的慢性肥厚性鼻炎患者(B组)进行比较。结果A组术前鼻黏膜纤毛MTR为(7.64±1.56)mm/min;B组为(7.46±1.65)mm/min,其差异无统计学意义(P>0.05);A组术后3、6个月鼻黏膜纤毛MTR为(6.89±2.01)mm/min、(7.14±1.76)mm/min,分别与术前比较差异无统计学意义(均P>0.05);B组术后3、6个月鼻黏膜纤毛MTR为(3.16±1.32)mm/min、(3.12±1.29)mm/min,分别与术前比较差异有统计学意义(均P<0.01);两组术后3个月鼻黏膜纤毛MTR比较差异有统计学意义(P<0.01);两组术后6个月鼻黏膜纤毛MTR比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论低温等离子射频治疗慢性肥厚性鼻炎对鼻黏膜纤毛无明显影响,没有破坏鼻黏膜纤毛的正常生理功能。     

PM2.5暴露对人类咽部微生态的影响CSCD

目的探讨PM2.5对人类咽部微生态的影响。方法 选择2016年12月~2017年3月我院冬季雾霾严重时就医的咽炎患者和非咽炎患者做咽部微生物的检测,2017年6~9月非雾霾环境下的咽炎患者和非咽炎患者做咽部微生物的检测。结果 暴露PM2.5环境下的咽炎患者咽部正常菌种检出率明显降低(P <0.05),条件致病菌检出率明显增加(P <0.05)。结论PM2.5可以破坏咽部微生态平衡,导致正常菌群种类及数量减少,致病菌易于定植,破坏咽部黏膜正常结构,导致咽炎发生,并且损伤程度随着PM2.5日均值浓度及暴露时间的增加而加重。     

大豆黄酮对卵巢切除大鼠鼻黏膜上皮细胞凋亡的保护作用

目的：观察双侧卵巢切除诱导大鼠鼻黏膜上皮细胞凋亡，研究尼尔雌醇、大豆黄酮对此的保护作用。方法：将60只大鼠随机分为4组：健康对照组，卵巢切除组，卵巢切除＋尼尔雌醇组，巢巢切除＋大豆黄酮组。各组动物分期分3批处死，流式细胞仪检测各组动物鼻中隔黏膜的早期凋亡细胞。结果：双侧卵巢切除后，大鼠鼻黏膜的早期凋亡细胞百分数增高，术后60d达到新的平衡。大豆黄酮、尼尔雌醇干预组与健康组比较，早期凋亡细胞无明显改变。结论：雌激素替代和大豆黄酮可通过减少凋亡细胞而保护鼻黏膜免受雌激素缺乏的损害。     

金黄色葡萄球菌感染对气液界面培养鼻黏膜上皮细胞间紧密连接及细胞活力的影响

目的　构建金黄色葡萄球菌感染分化生长的鼻黏膜上皮细胞体外模型,分析金黄色葡萄球菌感染对鼻黏膜上皮细胞间紧密连接及细胞活力的影响。方法　使用金黄色葡萄球菌标准株及慢性鼻-鼻窦炎临床分离株感染气液界面培养的人鼻黏膜上皮细胞,倒置显微镜观察处理后上皮细胞形态,电压-电阻计测定跨上皮细胞阻抗,FITCdextran检测上皮细胞间紧密连接相对通透性,LDH释放检测上皮细胞活力。结果　慢性鼻-鼻窦炎临床菌株破坏上皮细胞间紧密连接,显著降低跨上皮细胞阻抗值、增加上皮细胞层通透性、降低上皮细胞活力（P <0.05）。结论　慢性鼻-鼻窦炎患者鼻腔金黄色葡萄球菌可通过影响鼻黏膜上皮细胞活力,破坏鼻黏膜上皮其细胞间紧密连接,参与鼻-鼻窦炎鼻黏膜损伤病理过程。     

辐射对豚鼠鼻黏膜组织结构及微血管的影响

目的：探讨辐射对豚鼠鼻黏膜结构及微血管的损伤。方法：选择健康豚鼠84只，随机分为对照组（12只）及照射组（72只）。均在同样条件下喂养。将照射组豚鼠置于直线加速器射线内照射，每周1次，每次照射5Gy，计3周，总剂量15Gy，建立辐射损伤动物模型。分别于照射后0．5、1.0、2．0、3．0、5．0、6．0个月处死动物12只，随机取6只做鼻腔黏膜微血管铸型，另6只做病理检查。对照组在假照射后6个月处死动物，随机各选6只分别做鼻黏膜微血管铸型检查和病理检查。结果：照射组豚鼠的鼻黏膜辐射后早期表现为急性炎症反应，黏膜大量坏死、脱落，电镜下见仅少部分黏膜表面还被覆着正常的纤毛结构。以后黏膜开始修复，至6个月时基本结束，但大部分黏膜失去了正常的纤毛柱状上皮结构特点，部分区域甚至代为组织转化的鳞状上皮；微血管铸型可见，早期改变为毛细血管扩张充血及血管内皮细胞肿胀，以后逐渐出现毛细血管的扭曲变形、闭塞及中断，毛细血管数量大量减少，致血液回流障碍，微静脉萎瘪。后期部分区域出现新生的毛细血管，但结构紊乱，不具备微循环的功能。结论：鼻黏膜的损伤、晚期的鳞状上皮组织转化以及鼻黏膜微循环的破坏是放疗后鼻腔功能障碍的病理学基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B对人鼻黏膜上皮细胞的促炎作用

目的探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B（staphylococcus aureus enterotoxin B，SEB）对原代培养的人鼻黏膜上皮细胞释放促炎因子和（或）趋化因子的作用。方法将无血清原代培养的人鼻息肉及下鼻甲上皮细胞分别在SEB1、10、100ns／ml，白细胞介素（intedeukin，IL）1β 20ng／ml及SEB 10ng／ml＋地塞米松13ng／ml等不同条件下孵育，12、24和48h后采用原位杂交方法检测鼻黏膜上皮细胞分泌的IL-5和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granuloyte macrophagc colony stimulating factor，GM-CSF）在mRNA水平的变化。结果①SEB刺激鼻黏膜上皮时，IL-5和GM—CSF mRNA表达增加，在一定范围内呈现时间和剂量依赖性，以10ng／ml、24h时最明显（P〈0．05），且鼻息肉组的表达高于下鼻甲组，差异具有统计学意义（P〈0．05）；②IL-1β 20ng／ml组IL-5和GM-CSF mRNA表达增加不及SEB 10ng／ml组明显，差异具有统计学意义（P值均〈0．05）；③SEB 10ng/ml＋地塞米松13ng／ml组的IL-5和GM-CSF mRNA表达强度较SEB 10ng／ml组弱，差异具有统计学意义（P值均〈0．05）。结论SEB对原代培养的人鼻黏膜上皮细胞具有促炎作用。     

雌激素替代对双侧卵巢切除大鼠鼻黏膜上皮细胞凋亡的保护作用

目的观察并比较滴鼻和胃灌注尼尔雌醇对双侧卵巢切除术后所致大鼠鼻黏膜上皮细胞凋亡的保护作用及二者的差别.方法将60只雌性大鼠随机分为对照组(不切除卵巢)、A组(双侧卵巢切除)、B组(双侧卵巢切除加尼尔雌醇胃灌注)、C组(双侧卵巢切除加尼尔雌醇滴鼻),每组15只,用流式细胞仪分别检测各组动物术后15、30、60 d鼻中隔黏膜阳性细胞百分率和荧光强度指数.结果双侧卵巢切除后,大鼠鼻黏膜阳性细胞百分率增高;尼尔雌醇胃灌注后15 d与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),术后30 d恢复正常;尼尔雌醇滴鼻后15、 30 d与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),术后60 d恢复正常.结论尼尔雌醇胃灌注和滴鼻可通过减少凋亡细胞而保护大鼠鼻黏膜免受雌激素缺乏的损害,与胃灌注法相比,滴鼻法达到治疗效果所需时间较长.     

中药冲洗对鼻黏膜纤毛超微结构的影响

目的：观察慢性鼻-鼻窦炎患者在鼻内窥镜术后应用鼻窦炎口服液冲洗鼻腔,对鼻黏膜纤毛超微结构的影响。方法：对30例接受ESS的慢性鼻-鼻窦炎患者,术后分A、B、C三组用不同方法处理,对各组患者分别于术前、术后3个月取上颌窦口周围黏膜进行电镜观察,另取2例作为健康对照。结果：术前各组黏膜上皮纤毛脱落,排列紊乱,间质水肿,可见中性粒细胞及杯状细胞。线粒体减少,明显肿胀,出现空泡。纤毛融合,微管结构异常;术后A、B组纤毛排列较整齐,粗细亦均匀,方向较一致,且纤毛丰富、密集,“9+2”微管结构清晰,线粒体狭长致密,与健康对照组结构无明显差异;术后C组可见纤毛数量明显增多,排列尚整齐,方向欠统一,并可见大量短纤毛,线粒体仍肿胀,仍可见病理性改变。结论：鼻内镜手术后应用鼻窦炎口服液冲洗能促进鼻黏膜纤毛结构的恢复。     

沉默HIF-1α基因对鼻黏膜上皮细胞生长因子表达的影响

目的 采用短发夹 RNA(shRNA)特异性沉默人鼻黏膜上皮细胞(HNEC)缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)基因,观察对其表达血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)β1、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 的影响。方法 体外培养原代鼻黏膜细胞,设计合成以腺病毒为载体GFP标记的shRNA,将HNEC分为空白对照组、阴性对照组(ad-HIF shRNA-neg)、ad-HIF shRNA干扰组。采用RT-PCR和Western blotting技术检测转染后相应因子蛋白和mRNA的表达情况。结果 成功合成ad-HIF shRNA并转染入HNEC中。转染ad-HIF shRNA后,HIF-1α蛋白及mRNA表达分别下降40%和39%(q=31.469,16.590);同时VEGF、TGF-β1、bFGF的蛋白及mRNA表达也随之下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 HIF-1α mRNA的shRNA能有效地使HNEC的HIF-1α基因沉默,进而有效地抑制VEGF、TGF-β1和bFGF的表达, 提示HNEC中HIF-1α可能通过直接或间接途径调控着VEGF、bFGF和TGF-β1的表达。     

聚焦超声对黄羊鼻黏膜形态学的影响

目的研究聚焦超声对黄羊鼻黏膜形态学的影响.方法运用中国重庆海扶技术公司生产的CZB型超声波鼻炎治疗仪,在不同剂量参数下对离体牛肝进行直线扫描,观察聚焦超声在离体牛肝中形成的生物学焦域形态是否满足设计需要;以选择参数在鼻内镜下扫描活体黄羊下鼻甲鼻黏膜,通过大体形态、光镜和透射电镜观察聚焦超声扫描后黄羊鼻黏膜组织形态学的改变.结果离体牛肝实验结果显示在选择剂量参数下可获得满足设计需求的生物学焦域形态.聚焦超声扫描黄羊下鼻甲后,其黏膜外观和色泽无明显改变,但扫描后第3天鼻腔分泌物增加、第7天恢复正常.扫描后第3天,光镜下显示黄羊鼻黏膜上皮层完好,鼻黏膜下层出现散在、点状的凝固性坏死.凝固性坏死区血管内皮细胞变性、部分血管内血栓形成,神经细胞空化变性或坏死,腺体细胞部分或完全坏死.电镜显示鼻黏膜上皮杯状细胞、纤毛柱状上皮细胞等结构正常.在第7天凝固性坏死区出现胶原纤维增生等组织修复表现.在第14天坏死组织开始溶解吸收,部分切片显示坏死组织消融.结论在选择参数下聚焦超声能量可特异性沉积于鼻黏膜下层,对富含血管、神经和腺体的鼻黏膜组织消融,但不破坏鼻黏膜上皮层等非靶点区结构,从而可能维护鼻黏膜黏液纤毛系统功能.     

糖皮质激素对鼻黏膜放射性损伤后黏液纤毛传输功能的影响

目的观察鼻腔局部应用糖皮质激素对鼻黏膜放射性损伤后黏液纤毛传输功能的影响,探讨糖皮质激素治疗在鼻黏膜放射性损伤中的作用。方法38例鼻咽癌患者随机分为实验组和对照组,实验组于放疗开始后给予布地奈德鼻腔局部治疗,采用糖精试验分别测定放疗前及放疗后各阶段的鼻腔黏液纤毛传输时间（mucociliary transporttime,MTT）。对照组除不使用布地奈德,其他治疗均与实验组一样。结果两组中放疗后各阶段鼻腔MTT较放疗前显著延长,呈时间依赖性;放疗后各阶段实验组和对照组的MTT比较有统计学意义,鼻腔局部使用糖皮质激素能显著减少放疗后鼻腔黏液纤毛传输时间。结论鼻腔应用糖皮质激素对鼻黏膜放射性损伤后黏液纤毛传输功能具有一定的保护作用。     

大豆黄酮对卵巢切除大鼠鼻黏膜上皮细胞凋亡的保护作用

目的　观察双侧卵巢切除诱导大鼠鼻黏膜上皮细胞凋亡 ,研究尼尔雌醇、大豆黄酮对此的保护作用。方法　将 60只大鼠随机分为 4组 :健康对照组 ,卵巢切除组 ,卵巢切除 +尼尔雌醇组 ,卵巢切除 +大豆黄酮组。各组动物分期分 3批处死 ,流式细胞仪检测各组动物鼻中隔黏膜的早期凋亡细胞。结果　双侧卵巢切除后 ,大鼠鼻黏膜的早期凋亡细胞百分数增高 ,术后 60d达到新的平衡。大豆黄酮、尼尔雌醇干预组与健康组比较 ,早期凋亡细胞无明显改变。结论　雌激素替代和大豆黄酮可通过减少凋亡细胞而保护鼻黏膜免受雌激素缺乏的损害     

核因子κB信号转导通路对鼻黏膜上皮细胞的细胞因子调控

目的 探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导体外培养的鼻黏膜上皮细胞致炎后核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的活性变化对局部细胞因子的调控作用.方法 取11例经鼻蝶垂体瘤切除术患者的蝶窦黏膜,采用无血清原代培养法分离培养黏膜上皮细胞,传3到4代后,经LPS(1 mg/L)诱导以及加入NF-κB阻断剂Wedelolactone前后,应用凝胶电泳迁移率分析法检测NF-κB的DNA结合活性,采用反转录-聚合酶链反应法检测各种细胞因子如白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-5、IL-6、IL-8、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、正常T细胞活化表达和分泌调节物(regulated on activation,normal T expressed and secreted,RANTES)、嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin)、eotaxin-2、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)mRNA的表达水平.应用统计软件SPSS17.0对数据进行分析.结果 LPS诱导鼻黏膜上皮细胞后平均(-x±s,以下同)NF-κB DNA结合活性相对值为2.050±0.305,对照组为1.013±0.144,差异有统计学意义(P=0.004).对照组鼻黏膜上皮细胞IL-1β、IL-8和COX-2 mRNA均未见表达,经LPS诱导后相对表达量分别为1.057±0.041、0.950±0.042、0.117±0.012,LPS诱导前后差异有统计学意义(P值均为0.000).应用NF-κB阻断剂Wedelolactone后NF-κB DNA结合活性以及IL-1β、IL-8和COX-2 mRNA的表达水平分别下调至0.917±0.188、0.180±0.008、0、0,与LPS组比较差异有统计学意义(P值分别为0.002、0.000、0.000和0.000).其他各检测指标在各组检测值均为0.结论 NF-κB通路参与了LPS体外诱导人正常鼻黏膜上皮细胞IL-1 β、IL-8和COX-2 mRNA转录水平的调控.     

滴鼻灵对鼻黏膜纤毛清除率的影响

药物滴鼻是治疗鼻病的重要手段.滴鼻药经鼻黏膜吸收,可能会对鼻黏膜产生不同程度的损害或刺激,这种损伤是否可逆,是经鼻腔给药可行性关键所在.药物对鼻黏膜的损害,最先受损的是纤毛系统,故鼻黏膜纤毛功能的检测对判断经鼻腔给药的可行性具有重要的作用[1].检测鼻黏膜纤毛功能的方法很多,糖精试验[2]仍不失为一种简单而有效的方法[3].滴鼻灵是我科研制的一种治疗变应性鼻炎的纯中药滴鼻剂,并且具有较好的临床疗效[4].为了解其对鼻黏膜有无影响,笔者观察了30例正常人和40例常年性变应性鼻炎(PAR)患者的鼻黏膜的纤维清除率(纤毛清除速度).