醛固酮自分泌环在高糖致人系膜细胞损伤中的作用

目的研究高糖环境下人系膜细胞(HMC)中醛固酮自分泌环及活性氧(ROS)、癌胚纤连蛋白(FN)表达水平的变化,进一步探讨醛固酮自分泌环与ROS、癌胚FN mRNA表达的关系。方法常规培养HMC,取对数生长期细胞分为5组:正糖组(5mmol/L D-葡萄糖),渗透压对照组(5mmol/L D-葡萄糖+20mmol/L L-葡萄糖),正糖+依普利酮组(5mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L依普利酮),高糖组(25mmol/L D-葡萄糖),高糖+依普利酮组(25mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L依普利酮)。采用RT-PCR法检测醛固酮合酶(CYP11B2)、11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ(11βHSD2)、癌胚FN mRNA表达水平,Western blotting检测CYP11B2蛋白表达水平,放射免疫法分析细胞培养液中醛固酮水平,通过激光共聚焦显微镜观察盐皮质激素受体(MR)蛋白表达及转位情况,荧光显微镜和荧光酶标仪检测细胞内ROS水平。结果与正糖组比较,高糖组HMC细胞CYP11B2 mRNA及蛋白表达上调,ROS和癌胚FN mRNA表达亦上调,培养液中醛固酮浓度升高(P<0.05)。高糖可促进MR蛋白发生核转位,定量分析显示高糖组胞质/胞核荧光强度比值较正糖组降低30%(P<0.05)。与高糖组比较,高糖+依普利酮组ROS及癌胚FN mRNA表达下调(P<0.05)。结论高糖负荷可通过激活HMC局部醛固酮自分泌环而导致HMC损伤。     

脂联素对高糖环境下人肾小管上皮细胞凋亡及氧化应激水平的影响

目的探讨脂联素对体外高糖环境下培养的人近曲肾小管上皮细胞(HK-2细胞)凋亡及氧化应激水平的影响。方法将人近曲肾小管上皮细胞分为3组:正常对照组(5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(30.0mmol/L D-葡萄糖)、高糖+脂联素组(30.0mmol/L D-葡萄糖+2.5μg/ml脂联素),各组细胞分别培养24、48、72h后,采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,实时荧光定量PCR测定细胞血红素加氧酶-1(HO-1)及衔接蛋白p66Shc mRNA表达水平。结果与正常对照组相比,高糖组细胞凋亡率增高,细胞培养液内SOD活性下降,MDA含量增高,同时诱导细胞HO-1及p66Shc mRNA表达上调,且呈时间依赖性(P<0.05)。与高糖组相比,高糖+脂联素组细胞凋亡受到抑制,细胞培养液内SOD活性增高,MDA含量降低,细胞HO-1 mRNA表达进一步增强,而p66Shc mRNA表达降低,呈时间依赖性(P<0.05)。结论随时间延长,高糖环境可引起HK-2细胞过度凋亡和高水平氧化应激;脂联素可通过延缓细胞凋亡和抑制氧化应激来发挥对肾脏的保护作用。     

转录共激活子p300及表观修饰在高糖致人系膜细胞代谢记忆中的汇聚作用

目的 以人系膜细胞(HMCs)作为体外模拟代谢记忆的研究对象,观察转录共激活子p300及组蛋白乙酰化蛋白H3(Ac-H3)、Ac-H4的表达规律,并探讨p300在其中的潜在汇集点作用.方法 将培养的HMCs按以下分组处理:①高糖诱导代谢记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d)、渗透压组(LG,NG+20mmol/L L-葡萄糖×2d),高糖组(HG,25mmol/L D-葡萄糖×2d)、记忆组(M1、M2、M3组,25mmol/L D-葡萄糖×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3、6、9d)、持续正糖组(NC,5.5mmol/L D-葡萄糖×9d).②糖其化终产物记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d);正糖+AGEs组(AGEs,5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d);AGEs记忆组(AGEs-M,5.5mmol/L D-葡萄糖+250μg/ml AGEs×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);BSA组(NG+BSA,给予同浓度BSA对照).③H2O2模拟氧化应激记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×30min);正糖+H2O2组(H2O2,5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min); H2O2记忆组(H2O2-M,5.5mmol/L D-葡萄糖+100μmol/L H2O2×30min+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);正糖对照组(NG3,5.5mmol/L D-葡萄糖×3d).④蛋白激酶C(PKC)β2激活记忆模型,分为正糖组(NG,5.5mmol/L D-葡萄糖×2d);高糖组(HG,25mmol/L D-葡萄糖×2d);记忆组(M,25mmol/L D-葡萄糖×2d +5.5mmol/LD-葡萄糖×3d);空载体记忆组(HN,25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-null×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d); PKCβ2激活记忆组(PO,25mmol/L D-葡萄糖+Ad5-PKCβ2×2d+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d);PKCβ2抑制剂记忆组(PI,25mmol/L D-葡萄糖×2d+10μmol/L CGP53353+5.5mmol/L D-葡萄糖×3d).采用二氢二氯荧光素(DCFDA)及酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)的表达.Western blotting检测各组细胞p300、Ac-H3和Ac-H4及PKCβ2蛋白的表达水平.结果 HG组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达增加,分别较NG组增加了1.15倍、0.93倍和0.87倍(P＜0.05),同时伴有PKCβ2蛋白及胞内ROS水平上调;M1、M2、M3组p300、Ac-H3、Ac-H4、PKCβ2蛋白水平及ROS表达水平与NG组比较仍显著升高,即使M3组亦较NG组分别增加75％、49％、47％、98％和48％(P＜0.05).AGEs组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达上调,较对照组分别升高了1.73倍、1.08倍和1.05倍(P＜0.05),AGE-M组各蛋白较对照组分别增加了1.47倍、0.95倍和1.03倍(P＜0.05).H2O2组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达均升高,较对照组分别升高了1.03倍、0.85倍和0.79倍(P＜0.05),而H2O2-M组各蛋白表达较对照组的差异无统计学意义.与M组比较,PO组p300、Ac-H3和Ac-H4蛋白表达进一步上调,分别为M组的1.25倍、1.06倍和1.10倍(P＜0.05),选择性PKCβ2抑制剂CGP53353可以显著降低上述蛋白表达.结论 HMCs存在转录共激活子p300及表观修饰持续活化的记忆效应,p300可能系高糖致生化代谢及表观遗传记忆刺激的汇聚点.     

二甲双胍下调ROS-PKCβ2通路对高糖波动加重的人内皮细胞损伤的干预作用

目的观察波动性高糖与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA表达的影响,探讨活性氧(ROS)和蛋白激酶Cβ2(PKCβ2)在其中的作用及二甲双胍的干预作用。方法将培养的HUVECs分为7组:①正常糖(NG,5mmol/L D-葡萄糖)组,②正常糖空载体转染组(NN,NG+Ad5-null)组,③持续性高糖(SHG,15mmol/L D-葡萄糖)组,④波动性高糖(I HG,5mmol/L D-葡萄糖与25mmol/L D-葡萄糖每24h更换一次)组,⑤波动性高糖+PKCβ2转染(I HGB,I HG+Ad5-PKCβ2)组,⑥波动性高糖+二甲双胍(I HGM,I HG+20μmol/L二甲双胍)组,⑦波动性高糖+选择性的PKCβ2抑制剂CGP53353(I HGI,I HG+10μmol/L CGP53353)组或波动高糖+α-硫辛酸(ALA)(I HGA,I HG+62.5μmol/L ALA)组。RT-PCR法检测细胞VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,荧光酶标仪测定细胞ROS水平,激光共聚焦显微镜下检测PKCβ2蛋白表达和转位情况。结果与NG组比较,NN组的空载体转染对细胞无明显生物学意义(P>0.05)。SHG组和I HG组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平增加,分别为NG组的2.16倍、2.30倍、1.75倍和2.57倍、3.32倍、3.20倍,且I HG组增加更明显(P<0.05)。SHG组和I HG组PKCβ2核转位激活,定量分析显示胞质/胞核荧光强度比值较NG组分别下降了21%和26%,且I HG组下降更加明显(P<0.05);I HGB组PKCβ2核转位较I HG组更显著,胞质/胞核荧光强度比值为I HG组的75%,同时I HGB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达以及ROS水平亦显著增高,分别为I HG组的1.38倍、1.45倍和1.25倍(P<0.05)。I HGM组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平均较I HG组明显降低,为I HG组的44%、53%和39%;I HGM组PKCβ2核转位亦较I HG组减少,胞质/胞核荧光强度比值为I HG组的1.20倍(P<0.05)。结论波动高糖较持续高糖更易损伤HUVECs,该作用与ROS-PKCβ2活化密切相关;二甲双胍可通过抑制PKCβ2激活,减轻波动性高糖诱导的HUVECs损伤。     

完全弗氏佐剂预防链尿菌素引起糖尿病的机制研究

目的研究完全弗氏佐剂对链尿菌素(STZ)引起的糖尿病及胰岛炎免疫保护作用的机制。方法正常昆明种小鼠随机分为完全弗氏佐剂(CFA)组(A组)于腹腔内和双侧后跖部各注射CFA50μl,和对照组(B组),以同样方法注入等量的生理盐水。两周后均注射STZ(每公斤体重40mg/d,共5d),以血糖16.7mmol/L诊断为糖尿病,观察糖尿病的发病率,并在STZ注射后6周处死小鼠,观察胰岛β细胞和T细胞的Fas/FasL的表达。结果4周后糖尿病发病率,A组为0%,B组为80%(P<0.01);胰岛炎评分,A组为0.2,B组为2.52±0.48(P<0.01)。组织学检查示B组胰岛β细胞明显减少,并且胰岛内β细胞表达Fas,而A组胰岛数目明显较多,未见β细胞有Fas表达,两组胰岛浸润T细胞均有FasL表达。结论CFA显著抑制了T细胞在胰岛局部的聚集,同时抑制胰岛局部β细胞表达Fas,提示CFA抑制了免疫系统的激活或引起免疫抑制性细胞因子释放,抑制了β细胞表达Fas,避免了T细胞引起的β细胞凋亡,从而对胰岛局部β细胞起到免疫保护作用。     

α-硫辛酸对高糖作用下血管内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的 观察α-硫辛酸对高糖作用下血管内皮细胞的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响.方法 实验分3组:正常对照组(NG,5.5mmol/L葡萄糖);高糖组(HG,30mmol/L葡萄糖);药物干预组[30mmol/L葡萄糖+不同浓度α-硫辛酸(50、100、200μmol/L)].脐静脉内皮细胞株在不同条件下孵育48h,采用黄嘌呤氧化酶法测定各组内皮细胞SOD活性,以硫代巴比妥酸为底物检测MDA含量,ELISA法测定各组内皮细胞ICAM-1蛋白浓度,RT-PCR法检测内皮细胞ICAM-1 mRNA表达水平.结果 与NG组相比,HG组内皮细胞SOD活性明显降低(P<0.01),MDA含量、ICAM-1蛋白及mRNA表达水平明显上升(P<0.01);与HG组相比,药物干预组内皮细胞SOD活性明显升高(P<0.01),MDA含量、ICAM-1蛋白及mRNA表达水平明显降低(P<0.05).结论 α-硫辛酸可改善高糖作用下血管内皮细胞的氧化应激,抑制内皮细胞ICAM-1的表达水平.     

YAP对高糖培养大鼠心脏成纤维细胞活化作用的影响及其机制

目的 探究Yes相关蛋白(YAP)对高糖诱导的大鼠心脏成纤维细胞(CFs)增殖和转分化的影响及其作用机制。方法 分离培养1～3日龄SD大鼠CFs,用40.0 mmol/L葡萄糖诱导CFs,构建糖尿病心肌病(DCM)细胞模型,24 h后检测细胞YAP、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ)、结缔组织生长因子(CTGF)的表达水平。取原代大鼠CFs,分别设置正常糖(5.5 mmol/L D-Glucose,NG)组、高糖(40.0 mmol/LD-Glucose,HG)组、NG+维替泊芬(NG+VP)组、HG+VP组。VP为YAP抑制剂,剂量为0.5μmol/L。各组处理CFs24 h后,采用波形蛋白免疫荧光法鉴定CFs,Ki-67免疫荧光染色检测各组细胞增殖情况,Westernblotting检测各组YAP、α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ、CTGF蛋白表达水平。结果 免疫荧光法鉴定波形蛋白阳性,提示原代培养的细胞为大鼠CFs。Ki-67免疫荧光检测结果显示,与NG组比较,HG组CFs的Ki-67阳性率(%...     

BMP-7对高糖诱导近端肾小管上皮细胞外基质及NF-κΒ表达的影响

目的探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)对高糖诱导近端肾小管上皮细胞(HKc)表达细胞外基质及核转录因子-κΒ(NF-κΒ)的干预作用。方法采用人近端肾小管HKc细胞株,将细胞分为正常对照组(NG,5·5mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,25mmol/L葡萄糖)、HG 100ng/mlBMP-7组、NG 100ng/mlBMP-7组、高渗组(HM,25mmol/L甘露醇)。应用免疫细胞化学和ELISA技术检测细胞Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白(FN)表达,用凝胶电泳迁移率竞争试验(EMSA)检测NF-κΒ的表达。结果高糖作用下NF-κΒ活性和Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白表达显著增高,加入100ng/mlBMP-7后可显著抑制NF-κΒ活性及Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结论BMP-7可能通过抑制NF-κΒ活性而从转录水平抑制高糖诱导的近端小管细胞细胞外基质的过度表达。     

高糖状态下内脂素对血管内皮细胞单核细胞趋化蛋白1及细胞间黏附分子1表达的影响

目的探讨内脂素在高糖状态下对血管内皮细胞单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)蛋白表达的影响及机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为3组:空白对照组(0mmol/L葡萄糖处理)、生理葡萄糖组(5.5mmol/L葡萄糖处理)、高糖组(25mmol/L葡萄糖处理),分别用不同浓度内脂素(0、10、50、100ng/ml)培养24h。另取HUVEC,在p38MAPK特异性抑制剂SB203580预处理30min后,加入内脂素(100ng/ml)及葡萄糖(0、5.5、25mmol/L)培养24h。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HUVEC中p38MAPKmRNA表达量,采用Westernblotting检测HUVEC中磷酸化p38MAPK蛋白表达水平,并用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中的MCP-1、ICAM-1蛋白表达量。结果空白对照组、生理葡萄糖组中,内脂素促进HUVEC中p38MAPKmRNA转录、p38MAPK蛋白磷酸化以及MCP-1、ICAM-1蛋白的表达,并呈浓度依赖性(P<0.01);与空白对照组和生理葡萄糖组相比,高糖组内...     

叙利亚金黄地鼠胰岛局部血管紧张素Ⅱ的生成途径与机制探讨

目的 探讨以不同抑制剂阻断局部肾素血管紧张素系统(RAS)后叙利亚金黄地鼠胰岛细胞生成血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的变化.方法 分离纯化叙利亚金黄地鼠胰岛细胞,分为对照组、卡托普利组、糜蛋白酶抑索组、抑肽酶组、α-抗胰蛋白酶组、卡托普利+糜蛋白酶抑索组共6个组,加入血管紧张素Ⅰ后按组别依次加入PBS、卡托普利(终浓度1mmol/L)、糜蛋白酶抑素(终浓度1mmol/L)、抑肽酶(终浓度1mmol/L)、α-抗胰蛋白酶(终浓度50μg/ml)、卡托普利联合糜蛋白酶抑素(终浓度均为1mmol/L)干胰岛细胞,然后以酶联免疫分析法(ELISA)检测各组上清中AngⅡ的含量.结果 卡托普利组、糜蛋白酶抑素组上清AngⅡ含量差异无统计学意义(P=0.72),但分别较不加抑制剂的对照组减少了42.50%和50.94%(P<0.01),而α-抗胰蛋白酶和抑肽酶组分别较对照组减少了20.04%和18.67%(P<0.05),卡托普利+糜蛋白酶抑素组则较对照组减少了81.82%(P<0.01).结论 胰岛局部AngⅡ的生成除经典的血管紧张素转换酶(ACE)途径之外还存在糜蛋白酶途径;非疾病状态下由ACE途径和糜蛋白酶途径所生成的AngⅡ的量无显著差异.