乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析

目的 克隆应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节新型靶基因HBVDNAPTP1,构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并进一步分析HBVDNAPTP1在组织中的分布表达水平.方法 应用RT-PCR技术扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导以获得HBVDNAPTP1融合蛋白的表达,利用Western blot证实表达蛋白的特异性.应用UniGene数据库对HBVDNAPTP1基因的染色体中定位及组织分布表达水平进行分析.结果 RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导获得了HBVDNAPTP1重组蛋白的表达,Western blot证实了表达的重组蛋白的特异性.HBVDNAPTP1在多数组织中低表达,仅在脑垂体腺、扁桃体、舌、胸腺、气管与脐带中无表达.结论 成功构建了HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,利用大肠埃希菌原核表达系统获得了重组蛋白的表达,并初步了解了HBVDNAPTP1基因的染色体定位与组织表达水平.     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a( )-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a( )-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。     

XTP3基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建稳定表达乙肝病毒XTP3蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导融合蛋白的表达,制备兔抗XTP3蛋白多克隆抗体并检测该抗体在乙肝肝癌、正常肝组织中的作用效果。方法PCR获得XTP3基因片段,插入至pET-32a( )中构建原核表达载体pET-32a( )-XTP3,测序正确后转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定融合蛋白的表达。利用Ni 亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blotting及免疫组化验证。结果成功构建pET-32a( )-XTP3表达载体并在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的XTP3融合蛋白,目的蛋白分子量为52kD,SDS-PAGE分析表明为包涵体表达。经亲和树脂纯化后免疫新西兰兔,成功获得融合蛋白及兔抗XTP3多克隆抗体。ELISA检测证明多克隆抗体效价>1:128000。免疫组化证实本实验中XTP3多克隆抗体在肝癌组织中的表达呈明显的细胞膜阳性,特异性良好。结论成功表达、纯化了XTP3基因融合蛋白,获得高特异性、高效价兔抗XTP3多克隆抗体,为进一步研究XTP3蛋白的生物学特性奠定了基础。     

人NPTX2基因原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

目的 在大肠埃希菌中表达人神经元正五聚蛋白2(NPTX2),并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 双酶切 pReceiv-er-M15 NPTX2质粒获得人NPTX2全长cDNA,经Not I 和EcoR I 双酶切后,连接至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1中,经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,采用Western blotting鉴定表达产物,亲和层析法纯化GST-NPTX2蛋白.结果 经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pGEX4T-1-NPTX2构建成功,表达产物相对分子量为70kD左右,与预期值相符,Western blotting证实该蛋白具有免疫反应特异性,亲和层析法获得了纯化的GST-NPTX2蛋白.结论 构建了pGEX-4T-NPTX2原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了GST-NPTX2融合蛋白.亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究NPTX2的生物学功能奠定了基础.     

人心肌肌钙蛋白I第2和第4个密码子同义突变对其在大肠埃希菌中表达的影响

目的 对人心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因实行定点突变并进行原核表达，观察此突变对cTnI表达量的影响。方法 利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段，设计引物将其第2和第4个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体，并导人宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导表达，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot鉴定，观察突变对cTnI表达的影响。结果 突变后的cTnI基因与对照组相比在大肠埃希菌中得到高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。结论 成功克隆了cTnI基因，所设计的同义突变可促进cTnI在大肠埃希菌中的高效表达。     

小鼠附睾分泌蛋白Spink12的原核表达与纯化

目的原核表达带有His标签的小鼠附睾蛋白Spink12,对表达产物进行鉴定和纯化,以研究Spink12的免疫避孕效果。方法提取小鼠附睾组织总RNA,RT-PCR扩增不含信号肽的Spink12蛋白编码序列,以NdeⅠ和EcoRⅠ酶切后,将其连入原核表达载体pET28(a);经酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28(a)-Spink12,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞。融合蛋白经IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳和Western blotting免疫印迹鉴定。用Ni-NTA在非变性条件下利用不同的咪唑梯度浓度纯化融合蛋白6×His-Spink12。结果酶切和测序结果显示成功构建出原核表达载体pET28(a)-Spink12。重组质粒转化大肠埃希菌BL21并经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示表达出约9kD的融合蛋白6×His-Spink12,与理论分子量相符。融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的23.5%。用抗His单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹鉴定,检测到同样大小的条带。经纯化获得较高纯度的融合蛋白6×His-Spink12,纯度达91.1%。结论成功表达并纯化了融合蛋白6×...     

人前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建包含人前列腺干细胞抗原(PSCA)的原核表达质粒,并进行诱导表达、蛋白纯化及鉴定.方法 通过PCR扩增人PSCA基因片段,与过渡载体pGEM-T Easy连接后进行测序鉴定,鉴定正确后,将PSCA基因片段酶切并插入含有谷胱甘肽s-转移本科GST标签的原核表达载体pET42a,得到重组质粒pET42a-PSCA.将pET42a-PSCA转化大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达GST-PSCA融合蛋白,用Glutathione-Sepharose 4B柱对融合蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 PSCA基因的PCR产物大小与预期相符,测序结果与GenBank 中的PSCA序列一致.pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western blotting检测显示融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43kD.结论 成功构建了人PSCA的原核表达质粒,能在BL21菌株中表达,且纯化后得到较高纯度的GST-PSCA融合蛋白,为后续抗前列腺癌基因疫苗研究奠定了基础.     

人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10在大肠埃希菌中的诱导表达与鉴定

目的 构建稳定表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C/UbcH10)蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导其表达,纯化并鉴定该重组蛋白. 方法 通过PCR扩增获得UbcH10基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体,经EcpRI/Xho 1双酶切及测序验证止确后,转化至大肠埃希菌BL21,经IPTG(终浓度Immnol/L)诱导表达4h.采用SD6-PAGE、Westernblotting等方法鉴定表达产物,用Ni-Sepharose亲和层析和Sephadex G-50分子筛纯化UbcH10蛋自. 结果 成功构建UbcH10基因的原核表达载体,经IPTG诱导后在大肠埃希菌B121中获得大量重组蛋白.该重组蛋白以町溶形式表达,表观分子量约为29kD,表达量约占黹体蛋白总量的40%.Westem blotting检测在29kD附近出现预期条带,与目的 蛋白的理论计算值相吻合.纯化后的UbcH10蛋白终浓度为8.82mg/ml,纯度达90%以上. 结论 成功表达并纯化了 UbcH10重组蛋白,为进一步研究其结构、功能以及该蛋白在肿瘤发生发展过程中的作用奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定

目的重组表达结核分枝杆菌Rv0309蛋白,以进一步探讨其免疫效应。方法将结核分枝杆菌抗原Rv0309的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成Rv0309重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,进一步经GST亲合层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果获得了pGEX4T-Rv0309重组子,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组Rv0309蛋白,其条带大小约23000,与预期结果相符。结论成功地进行了结核分枝杆菌抗原Rv0309的基因克隆与重组表达,为进一步研制新型结核病疫苗打下了基础。     

类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因的克隆表达及表达产物抗原性鉴定

目的：克隆表达类鼻疽伯克霍尔德菌外膜蛋白Omp38,并对重组Omp38（rOmp38）蛋白的抗原性进行鉴定。方法：应用PCR技术对类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-28a（＋）。重组表达载体经鉴定后,对重组蛋白进行诱导表达纯化,利用Western印迹对重组蛋白的抗原性进行鉴定。结果与结论：构建了pET-28a/Omp38重组表达载体,Omp38基因得到高效表达,Western印迹显示rOmp38蛋白具有较好的抗原性。     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达

目的：构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体(hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素(hEnS)融合基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法：利用RCR的方法扩增hEDN基因，克隆人含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS后，以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PACE及Westen-blot分析及鉴定。结果：成功构建了抗肝癌HdsFv-hEDN融合基因原核表达载体；SDS-PACE和wbsten—blot分析显示，诱导表达产物出现一条Mr约为45．0KD的新生蛋白带，表达量占菌体总蛋白量的x％，主要以包涵体形式存在。结论：抗肝癌hdsFv—hEDN重组免疫毒素融合基因的成功构建及表达，为其进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。     

牛结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的原核表达和纯化

构建牛结核分枝杆菌ESAT-6基因的原核表达载体,诱导表达、纯化并初步鉴定该蛋白。方法:以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-22b(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)polys菌体,经IPTG诱导表达蛋白;利用Western-blot鉴定重组蛋白后,纯化目的蛋白。结果:所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致。经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现在6kDa处有特异性蛋白条带。纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论:成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。     

青霉素结合蛋白2a C-末端在大肠杆菌M15中的表达、纯化及鉴定

目的构建含目的基因mecA C末端的重组子并在大肠杆菌M15中进行蛋白表达。方法采用PCR方法扩增mecA C末端DNA，将其与表达载体pQE30连接；再通过PCR及双酶切鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒转化大肠杆菌M15后，用1mmol／L的IPTG进行诱导表达。应用Ni-NTA琼脂糖进行亲和层析纯化目的蛋白，并用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pQE30-mecA重组表达质粒，转化大肠杆菌M15，经IPTG诱导表达，亲和层析纯化获得分子量为39．7kDa的蛋白；Western blotting和肽指纹图谱证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。结论在大肠杆菌内成功表达具有活性的PBP2a，为后期研究和开发抗MRSA药物奠定了基础。     

丙型肝炎病毒E1E2蛋白原核表达载体的构建及表达产物的鉴定

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)包膜糖蛋白 (E1E2 )基因的原核表达载体 ,为研究HCVE1E2蛋白属性及基因免疫奠定基础。方法 :设计HCVE1E2区基因上、下游引物 ,分别引入BglⅡ及EcoRI酶切位点 ,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/HCV1- 30 11为模板 ,通过PCR扩增获得HCVE1E2区基因片段 ,将其克隆入原核表达载体pRSETA ,然后通过酶切和序列测定对其进行鉴定 ;将此表达载体转化入表达菌BL2 1(DE3)pLySs诱导表达 ,并采用SDS -PAGE对表达产物进行鉴定。结果 :经酶切及序列测定分析表明 ,成功地构建了重组原核表达载体pRSETA -HCVE1E2 ;SDS -PAGE显示目的蛋白大量表达 ,且呈非溶状态。结论 :HCVE1E2融合蛋白可以在大肠杆菌中大量表达 ,为HCVE1E2蛋白的制备及基因疫苗的研制奠定了基础。