高纯度木瓜蛋白酶的分离纯化和性质研究

目的建立木瓜蛋白酶的分离纯化工艺路径。方法采用初步采集处理,20%,40%硫酸铵分级沉淀、SP-sephadex C50柱色谱、羟基磷灰石柱色谱,从番木瓜乳汁中分离纯化木瓜蛋白酶。结果获得比活为1 184 U/mg的纯酶,活力回收率为55.79%,纯化的酶经SDS-PAGE呈单一条带,高效液相色谱呈单一条带,纯度达到99.31%。该酶耐高温,最适pH值为7.2,对酪蛋白的动力学常数(Km)为3.5×10-5mol/L。结论应用此方法成功纯化了高纯度的木瓜蛋白酶。     

固定化胰蛋白酶的性质研究

目的　测定固定化胰蛋白酶的催化特性和部分稳定性。方法　在相同的条件下,测定固定化和可溶性胰蛋白酶的活力,得其最适作用pH值和最适作用温度,再测定活力,得到各自的米氏常数(Km)值;测得两种状态酶的热稳定性和酸碱稳定性。同时测定了固定化胰蛋白酶的低温稳定性。结果　固定化和可溶性胰蛋白酶的最适作用pH值分别为8 .0～9. 0和7. 0～9.0 ,最适作用温度分别为6 0℃和5 5℃,Km值分别为2 . 32 6、1 42. 9mg·ml-1 ;固定化胰蛋白酶在5 5℃条件下,保温5h ,仍有78 92 %的活性;在4℃条件下,8d后,活性才略微下降,两周活性保留达90 %以上;在pH 9.0的活性未下降,在pH 7.0～1 0 .0范围内也比较稳定(相对活性>80 %)。结论　胰蛋白酶经固定化后,最适作用pH值范围变窄,最适作用温度和Km值升高;热稳定性和酸碱稳定性均有所增强     

温敏载体固定化木瓜蛋白酶的特性及其消化HCG抗体的应用

以温敏性材料N-羟基琥珀酰亚胺活化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)为载体制备固定化木瓜蛋白酶,对其酶学性质进行了研究。结果表明:固定化酶的最适pH值为7.5,最适温度为65℃,米氏常数为2.72 mg/mL;经过24次温敏循环操作,剩余相对活力86.6%;在4℃条件下放置60 d,剩余相对活力为71.5%。与游离酶相比,固定化酶pH值稳定性、热稳定性、操作稳定性和储存稳定性都有显著提高。将此固定化酶应用于HCG单克隆抗体消化,与纤维素固定化酶相比,水解能力更强,更适合于大分子的酶解,特别是抗体片段的制备。     

固载化木聚糖酶交联酶聚集体的制备及性质D

目的 提高木聚糖酶YS1069的稳定性、重复利用率以及便于从反应体系中分离。方法 本文将交联酶聚集体CLEAs技术与载体固定化技术相结合,用LKZ-128氨基型树脂对木聚糖酶CLEAs进行固定化,并对其性质进行初步研究。结果及结论 采用单因素法和响应面法对影响固定化酶活性的因素进行分析和优化,获得最佳固定化条件为: pH 9.0的酶液,以2 mL的异丙醇为沉淀剂,沉淀1 h,以1.59 g/L的京尼平为交联剂,交联2 h,20 ℃的环境中固定化9.25 h,加酶量为8 mg时回收率最高,达到65.63%,加酶量为60 mg时酶活性最高,达到190 U/g。重复使用10次后,其相对酶活仍为42.3%,说明具有良好的批次操作稳定性。该酶经过固定化后热稳定性和pH稳定性均得到了提高。     

Thiirancarboxamides as inhibitors of papain

Derivatives of the thiirancarboxylic acid building-block containing a peptide bond were synthesised and screened against the model cysteine protease papain. The most active of the series showed a second-order rate constant of inactivation comparable to that of the parent compound. The insertion of a peptide moiety seems to compensate the lack of a free carboxylate interacting with the histidinium ion at the enzyme's active site.     

木瓜酶促进大鼠血管内皮细胞成血管的功能研究

目的　通过体外鼠细胞模型实验,检测木瓜酶在体外培养环境下对血管内皮细胞成血管向分化的促进功能。方法　采用P3代大鼠血管内皮细胞,将木瓜酶溶解于完全培养基内,按照10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml浓度配置含木瓜酶的完全培养基,与空白对照组共同培养0、7、14 d,通过逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测成血管分化相关基因VEGF（血管内皮生长因子）、CD31（血小板-内皮细胞粘附分子）的表达水平,通过CCK-8法检测不同组细胞的增殖活力。统计学方法为方差分析。结果　经14 d培养,添加木瓜酶的细胞VEGF、CD31表达水平及增殖能力显著高于空白对照组,木瓜酶浓度达到50 μg/ml时VEGF表达水平达到最高,为空白对照组的3.28倍,CD31表达水平随着木瓜酶浓度升高而升高,最高达到空白对照组的3.66倍。结论　适宜浓度的木瓜酶能够在体外促进内皮细胞的成血管分化及增殖,表明木瓜酶对血管组织形成具有一定的促进作用。     

固定化谷氨酸脱羧酶转化γ-氨基丁酸的研究

目的用固定化谷氨酸脱羧酶转化制备γ-氨基丁酸(GABA)。方法以海藻酸钠与明胶为协同作用载体包埋固定化酶,考察影响固定化酶活性的因素,获得固定化酶的优化条件,并将酶应用于制备GABA。结果海藻酸钠、明胶、氯化钙和戊二醛浓度分别为2.5%,1.0%,3.0%和0.3%,硬化时间4 h,固定化酶的相对活性最高,酶活回收率达到65.3%。以谷氨酸为底物,固定化谷氨酸脱羧酶为催化剂,采用填充床反应器连续制备GABA,连续反应60 h,酶相对活性仍保持在初始值的76.9%,谷氨酸转化率为98.7%。结论该固定化谷氨酸脱羧酶可应用于生物转化法连续制备GABA。     

肺炎患者血清可溶性E、P选择素的变化及意义

目的探讨社区获得性肺炎(community acquired pheumonia,CAP)患者血清可溶性E、P选择素(soluble E-selectin,sE-选择素,soluble P-selectin,sP-选择素)的变化及意义。方法使用ELISA双抗体夹心法动态检测25例CAP患者治疗前后及10例健康对照组血清sE-选择素、sP-选择素的水平。结果肺炎组治疗前sE-选择素水平、sP-选择素水平明显高于对照组(tsE=3.307,P<0.01;tsP=3.995,P<0.01);肺炎组治疗后,sE-选择素、sP-选择素水平均较治疗前有明显下降(tsE=5.039,P<0.01;tsP=5.707,P<0.01);治疗后两者水平与对照组相比差异均无统计学意义(tsE=1.146,P=0.26;tsP=0.070,P=0.994)。sE-选择素水平与中性粒细胞计数呈正相关(r=0.598,P<0.01),而sP-选择素与中性粒细胞计数无明显相关(r=0.029,P=0.804)。结论sE-选择素、sP-选择素参与肺炎的发生发展过程,动态检测血清sE-选择素、sP-选择素水平有助于判断CAP病情及转归。     

头孢氨苄的酶法制备工艺研究进展

综述了酶法合成头孢氨苄的工艺方法研究进展。     

用固定化细胞生产D-氨基酸的研究

目的优化CPU 0 4 30 1菌株的发酵条件 ,提高酶活力 ,并建立D 氨基酰化酶酶活力的测定方法。方法对CPU 0 4 30 1菌株培养的碳源、氮源进行优化 ,同时观察温度、pH值、离子含量等对D 氨基酰化酶酶活力测定的影响。结果CPU 0 4 30 1经固定化后于 37℃反应 2 0h得产品 4 .78g ,纯度达 99.5 7%。结论CPU 0 4 30 1菌株经优化后 ,D 氨基酰化酶的产量和活力均明显提高 ,同时建立了准确、灵敏的酶活力测定方法。     

汞和金属离子及多硫化物对木瓜蛋白酶活性的抑制作用

目的半胱氨酸蛋白酶参与了很多动植物生理过程和病理过程,是Hg2＋及其化合物作用的潜在靶点。木瓜蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族中最具代表性、研究最为广泛深入的一种蛋白酶,本文以木瓜蛋白酶为模型, 研究了汞等金属离子及其化合物对半胱氨酸蛋白酶活性的抑制作用。结果 Hg2＋对木瓜蛋白酶活性的抑制能力很强（Ki=2×10^-7 mol·L^-1）。过量的还原型谷胱甘肽和半胱氨酸能够恢复木瓜蛋白酶的活性。多种金属离子（Cu^2＋、Ag^＋、Au^3＋、Zn^2＋、Cd^2＋、Fe^3＋、Mn^2＋、Pb^2＋、Yb^3＋）对木瓜蛋白酶的活性具有抑制能力,而且抑制能力与金属离子自身的软硬度具有良好的相关性。研究结果表明 Hg2＋ 可能作用于木瓜蛋白酶的活性中心。此外,本文首次研究了汞多硫化物复合物对木瓜蛋白酶活性的抑制作用,发现其表观抑制常数（Ki= 7×10^-6 mol·L^-1）与柳硫汞（Ki=2.7×10^-6mol·L^-1）十分接近,而且其caco-2细胞单层的表观渗透能力（1.9×10^-5cm/s） 也较好。结论汞多硫化物复合物可能通过与半胱氨酸蛋白酶或者其它含巯基蛋白分子作用,发挥生物学活性。本文的研究工作可能有助于阐明汞化合物（ 特别是朱砂等不溶性汞化合物） 的毒理及药理作用的机制。     

Peripheral soluble epoxide hydrolase inhibition reduces hypernociception and inflammation in albumin-induced arthritis in temporomandibular joint of rats

Rheumatoid arthritis (RA) is characterized by chronic inflammation of the synovial tissue, joint dysfunction, and damage. Epoxyeicosatrienoic acids (EETs) are endogenous anti-inflammatory compounds, which are quickly converted by the soluble epoxide hydrolase (sEH) enzyme into a less active form with decreased biological effects. The inhibition of the sEH enzyme has been used as a strategy to lower nociception and inflammation. The goal of this study was to investigate whether the peripheral treatment with the sEH enzyme inhibitor 1- trifluoromethoxyphenyl-3-(1-propionylpiperidin-4-yl) urea (TPPU) could prevent the hypernociception and inflammation in the albumin-induced arthritis model in rats’ temporomandibular joint (TMJ). After the induction of experimental arthritis, animals were assessed for nociceptive behavior test, leukocyte infiltration counts and histologic analysis, ELISA to quantify several cytokines and Western blotting. The peripheral pretreatment with TPPU inhibited the arthritis-induced TMJ hypernociception and leukocyte migration. Moreover, the local concentrations of proinflammatory cytokines were diminished by TPPU, while the anti-inflammatory cytokine interleukin-10 was up-regulated in the TMJ tissue. Finally, TPPU significantly decreased protein expression of iNOS, while did not alter the expression of MRC1. This study provides evidence that the peripheral administration of TPPU reduces hypernociception and inflammation in TMJ experimental arthritis.     

木瓜蛋白酶对凝血功能的抑制作用及机制的体外研究

目的：观察木瓜蛋白酶体外对凝血功能的抑制作用,并探讨其可能机制。方法：将不同剂量木瓜蛋白酶分别与贫血小板血浆（PPP）和富血小板血浆（PRP）作用,分为生理盐水组、10U/L组和20U/L组,分别以血凝仪测定PPP和PRP的凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）,以血气分析仪和血凝仪分别测定PPP的Ca2＋浓度和凝血因子V、VII、VIII、IX、X和XI活性（FV：C、FVII：C、FVIII：C、FIX：C、FX：C和FXI：C）;将新鲜全血与前述3种浓度木瓜蛋白酶作用,采用硅化管法测定全血凝血时间（CT）。同时测定0、20、40、60和80U/L木瓜蛋白酶PPP的PT和APTT值。结果：10 U/L和20U/L木瓜蛋白酶组PPP和PRP的PT和APTT值、全血CT值分别显著高于生理盐水组和10U/L木瓜酶组（P〈0.01）,FV：C和FVIII：C水平分别显著低于生理盐水组和10U/L木瓜酶组（P〈0.05）;三组PPP与PRP之间PT和APTT值、各组间Ca2＋浓度以及其余凝血因子活性差异均无显统计学意义（P〉0.05）。PPP的PT和APTT值均与木瓜蛋白酶剂量呈显著正相关（r=0.995和0.991,P〈0.01）。结论：木瓜蛋白酶可通过抑制凝血因子V和VIII活性,从而对凝血功能有剂量依赖性的抑制作用,具有抗凝的功效。