抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH),并构建其原核表达载体.方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VH cDNA,用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a( ),在T4 DNA连接酶作用下室温连接.重组质粒经酶切鉴定,阳性克隆测序并进行序列分析.结果 扩增出VH cDNA片段,大小约为370bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致.VH基因序列长度为366bp,编码122个氨基酸.VH基因属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ亚类.结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因,并成功构建其原核表达载体.     

整合素阻断剂AP25单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备整合素阻断剂AP25的单克隆抗体,鉴定其效价和特异性.方法 从抗原免疫BALB/c小鼠分离免疫脾细胞,通过杂交瘤技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选杂交瘤细胞株并进行扩大培养.采用小鼠体内诱生法制备腹水,进行纯化后得到抗AP25单克隆抗体,用ELISA和Western blot鉴定其效价和特异性.结果 ELISA检测抗AP25单克隆抗体效价可达1∶2×106,Western blot鉴定抗体特异性良好.结论 获得了能够高表达抗AP25单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水制备抗体,纯化后得到效价高、特异性良好的AP25单克隆抗体.     

抗HIV-1 gp120单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗HIV-1 gp120单克隆抗体,鉴定其特性,为进一步研制HIV治疗性抗体提供贮备。方法将HIV-1 gp120基因片段连接到经酶切的原核表达载体PEGX-4T-2中,利用大肠杆菌XL1-blue表达GST-HIV蛋白。表达的蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性克隆。重组免疫印迹分析(RIBA)和Western blot检测抗体特异性。结果构建的重组质粒的外源基因片段经测序与预期HIV-1 gp120抗原基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE可见1条相对分子质量(Mr)32 000的表达蛋白条带。获得6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养上清效价为10-3,小鼠腹水效价为10-5,抗体亚型均为IgG1。RIBA结果显示6株单抗皆只与HIV-1 gp120抗原反应。Western blot结果显示在Mr32 000处可见1条单一目的条带。结论获得6株稳定分泌抗HIV-1 gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研制抗HIV治疗性抗体奠定了基础。     

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)原核表达、纯化及多克隆抗体制备研究

目的构建H-FABP高效原核表达载体,并实现H-FABP的高效原核表达、纯化及多克隆抗体的制备。方法通过RT-PCR扩增人H-FABP的基因序列,将目的基因克隆入质粒pET28a构建原核表达重组质粒pET28a-H-FABP。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导H-FABP的表达,采用Q Sepharose F.F.阴离子层析柱等方法建立H-FABP的纯化工艺。用免疫胶体金法和Western blot鉴定纯化后重组蛋白免疫特异性,用重组表达蛋白制备兔抗H-FABP多克隆抗体。结果成功构建人H-FABP重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为15kD,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度>95%的目的重组蛋白。制备的抗H-FABP多克隆抗体的抗血清ELISA效价可达1∶512000。结论本研究在原核系统中成功表达了H-FABP重组蛋白,并制备多克隆抗体,为H-FABP的结构和功能研究及开发临床诊断试剂盒打下了基础。     

EDAG-1的原核表达及单克隆抗体的制备

目的 构建红系发育相关基因（eryzhoid develop associated gene，EDAG-1）原核表达系统并制备其单克隆抗体、以进一步研究EDAG-1调控细胞增殖、分化及凋亡的分子机制,探讨其临床应用前景。方法 本实验选用pGEX-4T-3载体,构建含GST标签的pGEX＋4T-3-EDAG-1原核表达载体、经过对表达体系进行优化．IPTG诱导、获得较高效率的GST-EDAG-1融合蛋白表达、纯化该蛋白，对BALB／C小鼠进行免疫。将免疫后小鼠的脾脏细胞和来源于同种系小鼠的SP2／0骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型和胸腺核苷激酶缺陷型）采用PEG介导的融合方式进行细胞融合实验．通过HAT培养基对融合细胞进行初步筛选．进而通过ELIsA实验对所获得杂交瘤细胞进行抗体表达验证。结果 成功构建了含GST标签的pGEX，4T-3．EDAG-1原核表达载体、并表达出较高纯度的EDAG-1蛋白，获得表达EDAG-1抗体的单克隆杂交瘤细胞：通过对单克隆抗体的初步实验表明．所获单克隆抗体具有很好的特异性，较低的背景和较好的稳定性。结论 通过原核表达途径制备EDAG-1单克隆抗体是可行的，所获单克隆抗体具有很好的特异性，较低的背景和较好的稳定性。     

诱生型一氧化氮合酶抗体的制备与初步应用

目的制备诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)特异性抗体并应用于iNOS检测。方法将iNOSN端片段装入原核表达载体pET 2 8a(+) ,在大肠杆菌BL2 1中表达 ,两步法纯化目的蛋白 ,使用纯化蛋白制备iNOS多克隆抗体。获得的抗血清用于小鼠巨噬细胞及小鼠脑缺血模型中iNOS的检测。结果得到具有较高表达量的融合蛋白 ,经两步纯化获得iNOSN端融合蛋白纯品 ,将此蛋白免疫家兔 ,得到iNOS多克隆抗体 ,Westernblot分析表明该抗体不与nNOS、eNOS交叉反应 ,而能检测组织、细胞中的iNOS。结论原核表达iNOSN端片段制备的iNOS抗体具有很好的反应性及特异性     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

Construction and Expression of pacA and gtfB-cat of Streptococcus Mutans Fused with ctxB in Prokaryotic Cells

目的:构建含变形链球菌表面蛋白A区编码基因(pacA)、葡糖基转移酶催化区编码基因(gtfB-cat)及霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的嵌合表达质粒并表达目的蛋白.方法:将目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB克隆至原核克隆载体pET32-a(+)构建嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,将其转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3),并测量其表达情况.结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,证实目的基因均正确插入到载体pET-32a(+)中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架,经诱导后表达目的蛋白,分子质量大小与预期一致.结论:成功构建了嵌合质粒pET-pa-cA-cat-ctxB,且它们均在原核细胞内获得正确表达.     

Preparation and primary identification of mouse anti-human B7-H4 monoclonal antibody

目的 制备鼠抗人B7-H4单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定.方法 用稳定表达B7-H4分子的L929/B7-H4转基因细胞免疫6-8周龄的Balb/c小鼠.取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,采用流式细胞术筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗B7-H4单克隆抗体的细胞株,并用Western blot和Dot blot鉴定其生物学特性.细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定T细胞增殖情况.结果 成功获得1株稳定分泌抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为5C8.Western blot 和Dot blot结果表明,5C8能与人B7-H4蛋白特异性结合.CCK-8实验显示,5C8可以阻断B7-H4 分子对T细胞增殖的抑制作用.结论 成功获得鼠抗人B7-H4单克隆抗体,为研究B7-H4分子在肿瘤中的作用提供了手段.     

变形链球菌pacA和gtfB-cat与ctxB嵌合表达质粒的构建及表达

目的:构建含变形链球菌表面蛋白A区编码基因(pacA)、葡糖基转移酶催化区编码基因(gtfB-cat)及霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的嵌合表达质粒并表达目的蛋白。方法:将目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB克隆至原核克隆载体pET32-a(+)构建嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,将其转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3),并测量其表达情况。结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,证实目的基因均正确插入到载体pET-32a(+)中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架,经诱导后表达目的蛋白,分子质量大小与预期一致。结论:成功构建了嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,且它们均在原核细胞内获得正确表达。     

子宫中隔切除术后预防粘连方法探讨

目的 探讨子宫中隔并不孕患者宫腔镜术后不同处理方法预防宫腔粘连的效果.方法 55例子宫中隔并不孕患者行腹腔镜监护下宫腔镜子宫中隔切除术(TCRS),术后针对不同患者采用不同术后处理措施,包括宫腔放置与不放IUD,是否进行人工周期治疗,部分患者术后使用GnRH-a类药物治疗术后第1、3个月行宫腔镜检查随访,宫内放置IUD的患者;于术后第3个月取环.结果 54例患者术后进行宫腔镜检查随访,其中40例分别于术后第1、3个月完成了术后2次宫腔镜检查,另14例只完成一次检查.宫腔术后放环与否对术后宫腔形态影响无差异(P>0.05),术后使用人工周期治疗患者较未使用者子宫内膜厚,此两者术后第3个月宫腔镜检查发现宫底创面均已有内膜覆盖.使用GnRH-a类药物患者术后官腔形态满意.结论 TCRS术后宫腔放置IUD无助于预防术后粘连的发生;术后人工周期治疗应更个体化并有针对性的使用GnRH-a类药物治疗.术后及时进行宫腔镜检查随访可防止术后宫底新粘连的形成.     

欧洲药典适用性认证介绍

目的介绍欧洲药典适用性认证程序,为国内药品监管机构和原料药生产企业提供信息,促进我国原料药生产企业的国际化。方法通过查阅调研欧盟相关药品法规和与EDQM同行面对面的交流,详细了解欧洲药典适用性认证的组织机构和具体程序。结果与结论欧洲药典适用性认证程序在对原料药的质量控制有重要作用,加强了药典的监管力度,进一步保证了原料药的质量、安全性和有效性。     

住院患者精神用药情况调查分析

目的：了解目前住院精神患者的药物使用情况。方法：采用一日法调查西安市精神卫生中心403例住院精神患者诊断和治疗情况，并与上海市精神卫生中心2004年调查结果相比较。结果：①传统精神药物使用显著减少，新型精神药物使用占据首位；②抗精神病药物使用趋向小剂量化；③本组联用丙戊酸盐类药物显著增多；④我院精神药物使用情况与上海精神卫生中心比较有显著差异。结论：近年来精神药物使用情况已发生了显著变化，与新型精神药物疗效好，副作用少，患者依从性高有关。     

不同方法治疗慢性宫颈炎的疗效分析

目的慢性宫颈炎是妇科最常见的疾病之一,可引起盆腔脏器炎症,并且与宫颈癌的发生关系密切。本文诣在探讨不同方法在慢性宫颈炎中的疗效。方法回顾性分析新乡市中心医院收治的210例宫颈炎患者,采用药物保妇康栓、聚焦超声治疗及宫腔镜下宫颈电切术的临床效果进行统计分析。结果宫颈电切术治疗有效率为97.9%,明显高于另外两组,差异有统计学意义。结论宫腔镜下宫颈电切术治愈慢性宫颈炎,并且切除宫颈移行带,减少宫颈癌发生。     

片剂溶出度影响因素分析

目的:考察片剂溶出度的影响因素,提高片剂溶出度,从而提高产品质量。方法:通过实验,研究各种参数对片剂溶出度的影响,选择出最佳工艺条件,如改进处方、控制颗粒硬度和大小、控制压力等工艺参数,用于指导大型生产,提高片剂溶出度。结论:崩解剂及润滑剂的用量对片剂溶出度影响较大,颗粒的硬度及大小、粘合剂的温度,压片压力对片剂的溶出度亦有影响;片剂直径大小对片剂溶出度影响不大。     

槲皮素代谢产物定性检出条件研究

目的:研究给予大鼠槲皮素后血浆中代谢产物的定性检出条件。方法:给予大鼠槲皮素单体(100mg.kg-1)后腹腔静脉取血,血浆样品经2mol.L-1盐酸(甲醇-水溶液)水解,采用高效液相色谱法对血浆样品中代谢产物进行定性分析。结果:大鼠给药后3h内取血、血浆样品经盐酸水解处理4h,可稳定检测槲皮素和异鼠李素,样品在—20℃条件下贮存稳定。结论:血浆样品采集时间、盐酸水解时间及贮存方式等不同均可影响代谢产物的有效检出。     

甲泼尼龙佐治毛细支气管炎疗效观察

目的探讨甲泼尼龙与布地奈德治疗毛细支气管炎的疗效。方法将182例毛细支气管炎患儿随机分成三组,三组均采用综合治疗,A组62例用甲泼尼龙静脉滴注,B组60例雾化吸入布地奈德,C组60例用静滴氢化可的松,观察三组喘憋、哮鸣音消失和住院时间。结果A组喘憋、哮鸣音消失时间及住院时间均比B,C组缩短（P〈0.05）。结论甲泼尼龙静滴治疗毛细支气管炎有效、安全、方便,明显加快治愈过程,优于布地奈德与氢化可的松。     

新疆维吾尔自治区基层医院平均住院日调查分析

目的 通过对新疆维吾尔自治区14个县乡级医疗机构住院患者平均住院日及影响因素进行分析,为县乡级医疗机构进一步提高医疗管理质量提供依据.方法 将2009-2010年1504例县乡级医院住院患者平均住院天数,按性别、年龄、院别、付费方式、疾病分类进行描述性统计和秩和检验分析.结果 不同性别间及院别间平均住院日差异均有统计学意义(均P＜0.05),男性平均住院日为10.39 d,女性为8.69d,乡级医院为9.27d,县级医院为9.50 d.不同年龄间平均住院日差异有统计学意义(P＜0.05),小于15岁组、15 ～24岁组、25～44岁组、45 ～65岁组、大干65岁组平均住院日分别为8.10 d、7.66d、8.83 d、10.26 d和11.33 d.自费患者平均住院日为8.39 d,新农合组为9.10 d,商业保险组10.17 d,社会基本医疗保险患者则为11.08 d.不同疾病分类间平均住院日差异明显,妊娠类平均住院日最短,为6.73 d,而肿瘤患者则为14.26 d.结论 不同性别、不同年龄段、不同疾病分类及不同付费方式间平均住院日存在差异,县级医疗机构和乡级医疗机构住院患者平均住院日也存在差异.     

复发性耳廓假性囊肿的治疗

目的 探讨不同方法对复发性假性耳廓囊肿的治疗效果.方法 对2008年5月至2012年2月在我科就诊的58例复发性假性耳廓囊肿分成2组,穿刺抽液+冷冻+加压包扎组(19例),手术切除囊肿前壁软骨+对穿缝合组(39例),随访3个月到1年,观察2组治愈率、复发率,有效率、并发症等情况.结果 对照组1次治愈后痊愈5例,复发14例,治愈率为26.3％,复发率为73.7％,有效率为78.9％,其中耳廓增厚6例,1例并发化脓性软骨膜炎.观察组治愈38例,复发1例,经过1次穿刺后治愈,治愈率为97.4％,复发率为2.6％,有效率为100.0％.所有患者无耳廓变形、增厚,无化脓性耳廓软骨膜炎的并发症.结论 囊肿前壁软骨切除+对穿缝合是治疗复发性假性耳廓囊肿的高效、首选办法,值得推广.     

绝经妇女宫颈涂片特点及诊断

目的:探讨绝经妇女宫颈病变的诊断及筛查的必要性。方法:对980例绝经妇女宫颈涂片特点进行回顾性分析。结果:未绝经组及绝经组宫颈Ⅱb涂片的检出率分别为5.17%及4.08%,两组比较差异无显著性(P>0.05)。两组涂片检查的敏感性无差别,特异性差异有显著性(P<0.05)。结论:对绝经妇女进行宫颈细胞学筛查是非常必要。