慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内转移对帕金森病大鼠模型的保护作用

目的探讨慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因直接转移对帕金森病(PD)大鼠的保护作用。方法将携带TH、GDNF基因并含启动子为Palb的四环素应答元件的慢病毒(Lv-TH-GDNF)和四环素反式作用子rtTA2s-M2病毒共同注射到SD大鼠左侧纹状体,用强力霉素(DOX)诱导大鼠目的基因GDNF和TH的表达。1周后在大鼠的同侧纹状体注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)损毁纹状体的DA能神经元。通过旋转行为、黑质TH免疫组化染色以及高效液相色谱-电化学方法(HPLC-ECD)检测纹状体DA含量评估其保护效应;通过RT-PCR、免疫印迹观察Lv-TH-GDNF在脑内的表达。实验与健康对照组、磷酸缓冲液(PBS)对照组进行比较。结果在6-OHDA损伤后4周,Lv-TH-GDNF+rt-TA2s-M2+DOX组大鼠阿扑吗啡诱发的旋转效应均明显低于PBS对照组(P<0.01),损毁侧的的黑质区TH阳性细胞表达强度、纹状体DA含量均明显高于PBS对照组(P<0.01),但二者均低于健康对照组(P<0.01)。RT-PCR、免疫印迹结果显示,与PBS对照组比较,Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2+DOX组大鼠纹状体TH、GDNF基因的表达明显增高(P<0.01)。结论慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内直接转移,在强力霉素诱导下可减缓6-OHDA诱发的大鼠DA能神经元进行性变性,具有保护作用。     

新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因的慢病毒载体的构建与表达

目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet-On四环素调控慢病毒载体。通过瞬间转染法包装出病毒上清,用实时荧光定量PCR鉴定滴度。将包装的慢病毒-TH-GDNF与rtTA2S-M2以相同感染复数(MOI)感染293T细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素对GDNF、TH基因mRNA和蛋白的表达调控。结果实验成功构建重组慢病毒载体质粒;生产的病毒浓缩后滴度为2.1×1011TU·L-1;感染293T细胞实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组可见GDNF、TH基因mRNA表达明显升高(P<0.01)和蛋白条带,阴性组未见。结论在改良的Tet-On调控系统的慢病毒载体上成功克隆大鼠GDNF、TH双基因,其表达受四环素类抗生素调控并未见背景效应。     

慢病毒介导shRNA干扰前列腺癌PC3细胞Keap1基因表达的研究

目的：针对Keap1构建shRNA慢病毒干扰载体,并评价慢病毒介导的RNA干扰在人前列腺癌细胞PC3中的基因沉默效应。方法：利用生物信息学方法设计针对Keapl的RNAi寡聚核苷酸序列;采用慢病毒载体构建Keapl的shR-NA载体,利用大肠杆菌进行重组表达,利用293T细胞包装得到重组腺病毒;依据绿色荧光蛋白（GFP）示踪,逐孔稀释法确定转染效率及滴度;以实时荧光定量法比较各靶序列的基因干扰效果。结果：筛选了所构建的4个Keapl靶向序列,以慢病毒载体构建完成对应Keapl的shR-NA质粒。通过瞬时转染筛选得到效率最佳（干扰效率达到80％）的靶序列和工作条件。结论：本研究成功构建并筛选了针对Keapl的shRNA慢病毒载体,有效抑制PC3细胞中Keapl的表达。     

慢病毒介导的siRNA沉默结肠癌HCT116细胞中Slug基因表达的影响

目的探讨慢病毒载体介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体在结肠癌HCT116细胞中的沉默效应。方法构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及Slug siRNA三组,应用qRT-PRC和Western blot方法分别从基因和蛋白水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果。结果转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05)。结论 Slug siRNA能明显沉默靶基因Slug的表达,并且可能成为潜在治疗肿瘤的新靶点。     

大鼠CRH基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建针对大鼠促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定。方法针对CRH基因设计4个RNAi靶点并分别构建入慢病毒骨架载体,测序鉴定。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T工具细胞后,用Western blot进行外源筛靶以确定有效靶序列。有效RNAi病毒质粒与辅助质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度。结果 Western blot外源筛靶显示3个靶点能有效敲减目的基因的表达。测定浓缩病毒悬液的滴度为1．5×109 T U／ml。结论成功构建了CRH基因的RNAi慢病毒载体,可用于CRH在应激反应中作用的研究。     

慢病毒载体体内转染大鼠角膜基质细胞的安全性实验研究

目的:研究病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(Lenti-EGFP)通过2种途径体内转染大鼠角膜基质细胞的安全性,为角膜相关疾病的基因治疗提供实验基础。方法:将Lenti-EGFP通过角膜基质注射和刮除角膜上皮敷贴带Lenti-EGFP的棉片2种不同方法体内转染大鼠角膜基质细胞,转染后定期在裂隙灯下观察,以3,7,26和48 d 4个不同时间点收集角膜,固定后切片,经HE染色后采用光镜、电镜检查和Tunel法检测细胞凋亡。结果:两组(1b组、1c组)大鼠转染了Lenti-EGFP的角膜各层细胞形态及超微结构与对照组(1a组)之间各组细胞凋亡百分率经比较其差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Lenti-EGFP通过上述2种转染途径均可安全的转染角膜基质细胞。     

慢病毒介导的NGF基因沉默对PC12细胞分化的影响

目的探讨慢病毒介导的神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因沉默后对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(pheochromocytoma cell,PC12)分化的影响及其机制。方法构建NGF shRNA慢病毒载体。培养PC12细胞,随机分为5组(n=3):1正常对照组(NC):PC12细胞置于DMEM/HG细胞培养液和促感染试剂polybrene中培养;2空病毒感染组(LV CON):PC12细胞置于空病毒和polybrene中培养;3慢病毒NGF shRNA1感染组(LV sh NGF1):PC12细胞置于慢病毒NGF shRNA1和polybrene中培养;4慢病毒NGF shRNA2感染组(LV sh NGF2):PC12细胞置于慢病毒NGF shRNA2和polybrene中培养;5慢病毒NGF shRNA3感染组(LV sh NGF3):PC12细胞置于慢病毒NGF shRN3和polybrene中培养。处理结束后,荧光显微镜下检测感染效率、荧光定量RT-PCR法检测细胞NGF mRNA表达水平、Western blot法检测慢病毒感染后细胞NGF、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)和磷酸化-ERK1/2(phosphorylated ERK1/2,p-ERK1/2)蛋白表达,细胞增殖检验试剂(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞活性,显微镜下观察PC12细胞形态,统计细胞突起长度和最大细胞直径。结果慢病毒感染PC12细胞的效率超过90%。与NC组相比,LV sh NGF3组NGF mRNA表达降低(P<0.05),NGF蛋白水平明显降低(P<0.05),ERK1/2蛋白表达和细胞活性无差异,p-ERK1/2蛋白表达有明显下降(P<0.01),细胞形态发生明显变化,细胞突起长度和最大细胞直径均变小(P<0.01),细胞分化被抑制。结论慢病毒介导的NGF基因沉默通过抑制ERK1/2活化,影响PC12细胞分化。     

司来吉兰对帕金森病模型大鼠黑质纹状体TH及GDNF表达的影响

目的观察司来吉兰对帕金森病(PD)模型大鼠黑质纹状体内酪氨酸羟化酶(TH)及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的影响,探讨司来吉兰对多巴胺能神经元的保护作用及机制。方法 72只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和司来吉兰组,每组均设4 d和8 d 2个亚组,各12只。模型组和司来吉兰组采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备PD模型,对照组皮下注射等体积葵花油。之后司来吉兰组每日灌胃咪多吡0.5 mg/kg,模型组和对照组每日灌胃等体积生理盐水,4 d和8 d组分别连续灌胃4 d和8 d。采用免疫组化法和Western blotting法检测黑质纹状体TH和GDNF表达水平。结果免疫组化法和Western blotting法检测结果均显示,对照组大鼠黑质纹状体可见多量TH阳性细胞表达和少量GDNF阳性细胞表达,8 d和4 d组差异均无统计学意义。模型组TH和GDNF阳性细胞表达均明显低于对照组(均P<0.05),8 d和4 d组差异均无统计学意义。司来吉兰组TH阳性细胞表达低于对照组而高于模型组,GDNF阳性细胞表达高于对照组和模型组(均P<0.05),且8 d组均高于4 d组(均P<0.05)。结论司来吉兰可减轻PD模型大鼠黑质纹状体多巴胺能神经元的损伤,其作用机制可能与增加GDNF表达有关。     

慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究

【摘要】目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接,转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞,根据转染效率得到最佳MOI值,并采用Real-timePCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284bp的目的基因片段,与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒,测序结果与预期完全符合,并成功包装慢病毒颗粒。最佳MOI值为20,转染效率为（90.32±3.61）%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAGpSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞,并可持续高表达apelin基因     

大鼠HSP27基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达shRNA的结构酶切插入慢病毒转移质粒pNL-IRES2-EGFP,产生pNL-HSP27-IRES2-EGFP,在293T细胞中与VSVG、pHelper包装产生慢病毒。48 h后收集上清液,离心过滤后进行病毒滴度测定。用构建正确的慢病毒质粒载体感染血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs),检测干扰效果。结果酶切和测序两种方法结果证明3种质粒载体的插入序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为3.12×109fu.L-1。重组慢病毒质粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1的RNA干扰效率最高,为0.771。结论成功构建靶向大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体。为进一步研究HSP27功能和用慢病毒进行基因治疗奠定基础。     

慢病毒载体介导的bFGF基因转染兔BMSCs的实验研究

摘要： 目的 观察在体外培养条件下, 慢病毒载体介导的碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 基因转染对兔骨髓基质干细胞 （BMSCs） 生物学特性的影响。方法 采用密度梯度离心法及贴壁筛选法获取 BMSCs; 利用慢病毒载体将 bFGF 基因转染到 BMSCs 中, 根据转染条件分为 bFGF 转染组、 空病毒组、 未转染组, 转染后分别对 3 组细胞的形态 bFGF mRNA 及蛋白表达、 细胞增殖情况、 细胞周期及碱性磷酸酶 （ALP） 活性进行观察。结果 采用密度梯度离心法和贴壁筛选法, 成功获得高纯度的 BMSCs。载有 bFGF 基因的慢病毒转染 BMSCs 后, 细胞形态无明显变化, 而 bFGF mRNA 与蛋白表达均明显增强、 细胞增殖曲线上移、 增殖期细胞比例增大、 ALP 活性明显增高, 与空病毒组及未转染组比较, 差异均有统计学意义 （P＜0.05)。结论 利用慢病毒载体将兔 bFGF 基因导入体外培养的 BMSCs, 目的基因获得稳定表达, 并且自身过表达的bFGF 可以促进BMSCs 的增殖与成骨分化。     

Neuritin基因高表达系统构建及转染大鼠雪旺细胞的鉴定

目的构建neuritin基因的高表达系统,观察其转染雪旺细胞后neuritin的表达。方法根据大鼠neuritin mRNA序列体外合成编码序列(CDS区),构建到pGH载体,与酶切后的GV208-绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体片段进行连接、转化、酶切及测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆,转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞。将雪旺细胞分为三组:空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)、高表达组(C组)。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞neuritin的表达。结果大鼠neuritin正确插入慢病毒载体,C组neuritin mRNA水平显著高于A组、B组(P<0.01)。检测到neuritin蛋白与GFP的融合蛋白。结论成功构建neuritin慢病毒高表达系统;其转染的雪旺细胞neuritin表达升高。     

巨细胞病毒IE2的红色靶基因与绿色荧光-慢病毒系统的建立及其对人神经干细胞的感染

目的 RNA干扰技术沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因巨细胞病毒IE2的表达,并初步研究慢病毒感染神经干细胞的可能性。方法以人巨细胞病毒IE2 mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向巨细胞病毒IE2的shRNA表达质粒,构建携带IE2的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞。通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western Blot确定最佳沉默IE2序列后,将有效的UTG-IE2质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,获取高滴度慢病毒。应用慢病毒感染人神经干细胞,观察神经干细胞被慢病毒感染的情况并检测神经干细胞的绿色荧光表达情况。结果成功构建IE2-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-IE2,RT-PCR及Western Blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞IE2 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低。构建的慢病毒可以成功感染神经干细胞。结论红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率,可实现慢病毒介导的RNA干扰在神经干细胞内的有效表达,并为相关研究提供技术支持。     

miR-21慢病毒干扰载体的构建及其对胆管癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的 构建miR-21慢病毒干扰载体,并观察其对胆管癌细胞增殖和迁移能力的影响.方法 针对目标序列,设计2条合适的PCR引物进行退火得到插入片段序列.将慢病毒干扰载体双酶切,纯化后与退火产物进行定向连接,产生慢病毒干扰质粒和阴性对照质粒,将其与慢病毒包装质粒混合物共转染293T,包装产生慢病毒.使用收获的慢病毒感染胆管癌细胞HUCCT1,荧光显微镜观察感染效率,细胞增殖和划痕实验分别检测HUCCT1下调miR-21后细胞增殖能力和迁移能力的改变.结果 成功构建了miR-21慢病毒干扰载体.感染胆管癌细胞HUCCT1后,miR-21表达降低;下调miR-21(LV-anti-miR21)组和感染空白慢病毒载体(LV-GFP)组相比,LV-anti-miR21组增殖能力和迁移能力均明显下降(P＜0.05).结论 成功构建miR-21慢病毒干扰载体;下调miR-21能够抑制胆管癌细胞的增殖,降低胆管癌细胞的迁移能力.     

灵芝孢子粉对帕金森病大鼠氧化应激反应和神经炎症反应的影响

目的研究灵芝孢子粉对帕金森病(PD)模型大鼠的氧化应激反应和神经炎症反应的影响,探讨灵芝孢子粉治疗帕金森病的潜在作用机制。方法采用脑内定位注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)建立PD大鼠模型,在模型建立成功后给予灵芝孢子粉治疗(25 g/kg)。给药30 d后,测定大鼠脑组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)和α-肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。结果灵芝孢子粉治疗组可明显降低PD模型大鼠脑组织中MDA、NO和TNF-α含量,增加GSH含量,提高SOD、GSH-PX的活性。结论灵芝孢子粉对PD模型大鼠具有保护作用,其机制可能与灵芝孢子粉减轻6-OHDA所致的氧化应激损伤和神经炎症反应有关。     

IL-10基因载体对大鼠血管平滑肌细胞增殖和球囊损伤后新生内膜形成的影响

目的 探讨白细胞介素-10 (IL-10)基因载体对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞(SHRVSMC)增殖和球囊损伤后新生内膜形成的影响.方法 成功构建慢病毒IL-10基因载体.自发性高血压大鼠(SHR)随机分为4组:正常对照组、模型组、损伤+空载体组(空载体组)、损伤+慢病毒IL-10基因治疗组(IL-10基因治疗组).大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,取出颈总动脉下段1/3行HE染色,计算机图像分析仪测量血管壁(中膜)/腔面积比(wall area/lumen are-a,W/L).颈总动脉段上1/3检测金属基质蛋白酶-12 (matrix metalloproteinase,MMP-12)的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)表达.结果 慢病毒IL-10基因治疗组W/L比值比模型组和空载体组明显减小;IL-10基因治疗组MMP-12的mRNA相对表达量比模型组和空载体组明显减小.结论 IL-10基因治疗能抑制大鼠体内血管平滑肌细胞增殖和球囊损伤后新生内膜形成,是有效的再狭窄治疗手段.     

表皮生长因子受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定研究

目的构建表皮生长因子受体(EGFR)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法合成EGFR基因的miRNA干扰序列,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-EGFR质粒,测序验证插入序列正确,连接到慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST中,获得pLenti6.3-EGFR-miRNA质粒,与慢病毒包装质粒Packaging MIX、POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent共转染293T细胞株,细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果 PCR和测序结果证实,EGFR miRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液滴度为1.8×106ifu/ml。结论成功构建EGFR基因RNAi慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定基础。     

肝癌特异性启动子调控的双靶位慢病毒载体的构建、鉴定及其在肝癌基因治疗中的应用

目的探讨survivin-CMV特异性启动子调控的双靶点慢病毒对肝癌细胞生长的影响。方法 RT-PCR扩增anti-AFP-scFv,测序鉴定,双酶切连接,获得pMD2G-anti-AFP-scFv质粒。针对已经筛选确定的IGF1R基因干扰有效序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与质粒pPRIME连接得到pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R质粒。RT-PCR扩增survivin-CMV肝癌特异性启动子,测序鉴定,与双酶切的质粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R连接,得到质粒sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。用sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R, psPAX2, pMD2G-anti-AFP-scFv共转染293T细胞,经过病毒空斑纯化,包装成慢病毒,测定病毒滴度。RT-PCR、Westernblot检测IGF1R表达,竞争抑制实验检测抗人AFP单链抗体活性。CCK-8法检测细胞生长。结果成功构建survivin-CMV肝癌特异性启动子调控的慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R;滴度为4.58×109PFU/mL;AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R抑制了肝癌细胞IGF1R表达,竞争实验显示抗人AFP单链抗体的基因高效表达,该慢病毒抑制肝癌细胞的生长。结论本次实验构建的慢病毒载体具有良好的靶向性,为肝癌生物治疗奠定了理论基础,提供了新的思路。     

培高利特对帕金森病大鼠保护作用的实验研究

目的　探讨多巴胺受体激动剂培高利特 (pergolide)对帕金森病 (PD)模型大鼠的抗氧化作用及其机制。方法　Wistar大鼠随机分为 4组 (对照组和 3个实验组 ) ,实验组预先于腹腔内分别注射培高利特 (1 0mg·kg-1)、选择性D2 受体拮抗剂氨黄酰基苯甲酰胺化合物 (Sulpiride ,2 5mg·kg-1)及培高利特 +Sulpiride。各组预处理均 1次 /天 ,连续 7d后 ,每组大鼠各取 6只分离纹状体 ,测定抗氧化物SOD及GSH活性。各组所剩大鼠则通过立体定位注射 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)制作PD模型 ,两周后比较各组阿朴吗啡诱导的旋转行为 ,并取损伤侧纹状体测定多巴胺 (DA)及其代谢产物多巴克 (DOPAC)、高香草酸 (HVA)的含量。结果　大鼠预先连续注射培高利特 7天 ,可明显增强纹状体SOD及GSH的活性 (P <0 0 5 ) ,并对抗 6 OHDA损伤后纹状体DA及其代谢产物含量的下降 (P <0 0 1) ,降低阿朴吗啡诱导的旋转行为 (P <0 0 5 )。而同时应用Sulpiride可抑制培高利特的促纹状体抗氧化作用 ,并消除其对DA能神经元的保护效应。结论　培高利特可通过增加纹状体抗氧化能力 ,对纹状体DA能神经元提供保护作用 ,其机制可能主要与刺激DAD2 受体有关。