FGF21-Fc融合蛋白体外活性试验的建立和优化

成纤维细胞生长因子-21(FGF21)-Fc融合蛋白体外活性试验的建立分为蛋白水平的结合活性试验和细胞水平的生物学活性试验2种。该研究建立了均相时间分辨荧光(HTRF)法用于检测FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho配体蛋白的结合活性;并自主构建了报告基因细胞,当FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho的结合,激活其FGF受体和诱导胞内信号转导所必需的共同受体,可通过检测萤光素酶活性,间接定量测定生物学活性。在建立过程中,分别对结合活性试验中样品和配体的浓度、供体和配体的稀释比例以及孵育时间进行优化,并进行了方法学验证,证明该HTRF技术具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白和β-Klotho的结合活性检测。随后,对生物学活性试验中胎牛血清的浓度、报告基因细胞的密度、试验板的类型以及细胞种板形式进行优化,并进行了方法学验证,证明该报告基因法具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白的生物学活性检测。本研究建立了FGF21-Fc融合蛋白的质控方法,为有同样活性检测难点的药物提供了一种分析技术参考,填补了国内外空白。     

CREKA/tTF融合蛋白表达及活性鉴定

目的制备用于靶向肿瘤血管中的凝血血浆蛋白的CREKA/tTF融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术构建CREKA与tTF的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coli BL21中表达,镍亲和色谱柱纯化,梯度透析复性。利用凝血时间,结合荧光定量测定等实验在体外鉴定该融合蛋白的活性。结果获得序列正确的CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,融合蛋白在E.coli BL21中高效表达。纯化后的融合蛋白具有引起血液凝固的功能,且能与凝血血浆蛋白结合。结论成功构建CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,CREKA/tTF融合蛋白具有TF凝血活性及CREKA的结合活性。     

抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定

目的 构建抗甲胎蛋白(AFP)重链可变区(VH)单域抗体融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达,并初步鉴定表达产物的活性.方法 从已构建的抗AFP单链抗体(ScFv)的载体中,经PCR扩增出VH 单域抗体基因,再克隆到融合蛋白表达载体pET32a( )中进行表达;用SDS-PAGE及Western-blot鉴定表达产物;并通过竞争抑制ELISA分析TrxA-VH融合蛋白的结合活性;细胞免疫组化染色分析其内化及结合情况.结果 VH 单域抗体基因全长339 bp,将其克隆到pET32a( )中,转化大肠杆菌可获得高效表达,Western-blot证实在相应分子质量处,有TrxA-VH融合蛋白的显色条带.经初步纯化和复性后,获得抗AFP的VH单域抗体融合蛋白.竞争抑制ELISA及细胞免疫组化证明,表达产物具有与AFP特异结合的活性.结论 成功构建了抗AFP的VH单域抗体融合蛋白,为临床的应用研究奠定了基础.     

肺癌靶向血栓蛋白hu3D3V_H-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF,并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因,克隆至表达载体pET22 b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性,凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性,并能活化FⅩ、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,hu3D3VH/tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性,为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

Fc融合蛋白在药学领域的研究进展

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型重组蛋白,其不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性,还具有一些抗体的性质,如通过结合相关Fc受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。对Fc融合蛋白及其在药学领域的研究进展进行了综述。     

肺癌靶向血栓蛋白hu3D3VH-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF，并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因，克隆至表达载体pET22b（＋），在E．coli B121（DE3）中表达，镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性，凝血实验和FX活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH／tTF／pET22b（＋）重组子，融合蛋白在E．coli B121（DE，）中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性，并能活化FX、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH／tTF／pET22b（＋）重组子，hu3D3VH／tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性，为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

两种具有双功能活性蝎毒蛋白融合体的构建

目的首次报道利用东亚钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-BmKAGAP产生两种不同的融合蛋白,目的是获得镇痛和抗肿瘤的双功能活性。方法融合蛋白是以嵌合毒素的形式进行构建,由三部分组成,包括促性腺激素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormoneL,HRH),两种不同类型的柔性连接物,以及BmKAGAP。克隆编码两种融合蛋白的基因并在大肠杆菌中实现可溶性表达。通过金属离子螯合亲和层析和阳离子交换层析方法对融合蛋白分离纯化,采用小鼠醋酸扭体法和MTT法测定融合蛋白的镇痛活性与细胞抑制活性。结果融合蛋白在小鼠模型中体现出镇痛活性(rLHRH-Tag(His)AGAP>rTag(His)-LHRH-L8-AGAP>rBmKAGAP),同时对肝癌细胞株Hep3B具有细胞毒活性(rLHRH-Tag(His)-AGAP>rBmKAGAP>rTag(His)-LHRH-L8-AGAP)。结论得到优化的双功能融合蛋白候选者为嵌合毒素rLHRH-Tag(His)-AGAP。     

治疗性抗体Fc融合蛋白药物研究进展

抗体融合蛋白已成为生物工程治疗药物中最成功的一员.其中的Fc融合蛋白,是一类通过基因工程平台技术将抗体的Fc部分与药物的活性成分融合表达而产生的蛋白.虽然构建Fc融合蛋白的初衷是为了延长其半衰期,但大量研究表明,Fc部分也参与免疫调节过程,引起一些免疫效应.随着生物治疗药物研究的飞速发展,Fc融合蛋白药物研究也取得了很大进展.此文从Fc融合蛋白的设计目的、设计原理、作用机理以及质量控制方面,对治疗性Fc融合蛋白药物的研究进展做一介绍.     

海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin的原核表达及其活性测定

本文利用原核系统表达海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin,并纯化和鉴定其活性。首先PCR法从模板分别扩增SUMO以及Harobin基因,再重叠PCR方法获得SUMO-Harobin融合基因,经NdeI、BamHI双酶切后,连入pET3C质粒,构建pET3C-SUMO/Harobin重组质粒。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导菌体表达,收集菌体分析发现大部分目的蛋白为包涵体。将获得的包涵体经尿素变性,用Ni-NTA亲和层析后,梯度透析复性融合蛋白。复性好的蛋白用Benzamidin Sepharose亲和层析纯化,得到高纯度的融合蛋白。进一步采用降解纤维蛋白原法测定融合蛋白活性。结果成功构建了pET3C-SUMO/Harobin重组载体,融合蛋白Harobin在原核系统中是以包涵体的形式存在。融合蛋白经过变性复性,并结合两步纯化法获得了90%纯度的融合蛋白;经过测定纤维蛋白原降解能力,显示融合蛋白具有降解纤维蛋白原的活性。     

Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究

目的:表达具有双功能特性的Exendin-4-GFP融合蛋白。方法:构建融合表达载体pET21a( )/Exendin-4-GFP,转化大肠杆菌BL21后,以IPTG诱导融合蛋白的表达,并利用镍金属螯合层析树脂对其进行纯化。采用胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)转染的CHO细胞考察融合蛋白的结合特性,并检测其生物活性。结果:含有融合表达载体的重组菌株诱导表达后,经SDS-PAGE及免疫印迹分析显示,31.0ku的融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,且具有Exendin-4的抗原活性。受体结合实验表明,该融合蛋白能够与GLP-1R特异性结合,在488nm激发光下呈现绿色荧光。体内活性实验表明,融合蛋白具有明显的降血糖活性。结论:本研究表达的Exendin-4-GFP融合蛋白同时具有Exendin-4的活性和荧光特性,为研究GLP-1受体功能以及Exendin-4与细胞相互作用的机制奠定了基础。