14-3-3蛋白生物学特征及相关药物发现

14-3-3蛋白是一种真核生物保守性调节蛋白,参与神经元发育、细胞周期和信号转导等多种生理过程调控,作为潜在的药物靶点受到高度关注。针对14-3-3蛋白及蛋白质-蛋白质相互作用的调节,发现了一些小分子14-3-3蛋白-靶蛋白相互作用稳定剂和抑制剂,将来可用于神经退行性疾病及肿瘤等疾病的药物干预。本文对14-3-3蛋白生物学特征及潜在药物靶点研究进行综述,为基于14-3-3蛋白的药物研发提供策略。     

用基因重组技术生产治疗性血浆蛋白制品

为探讨现代生物技术对血浆制药工业的影响，通过文献资料综述了国内外采用生物技术开发血浆蛋白制剂的现状及发展。表明重组的血浆蛋白制剂（尤其是第二代、第三代产品）越来越显示其强劲的竞争优势。结论是用基因重组技术生产血浆蛋白制品将最终取代血浆来源的产品用于临床。     

17β-雌二醇对卵巢切除小鼠海马内脑源性神经营养因子及神经营养因子 3表达的影响(英文)

目的　为确定雌激素可能具有的神经营养调节作用。方法　采用蛋白质印迹法检测上述指标的变化。结果　与卵巢未切除对照组相比 ,小鼠卵巢切除 10周后海马内脑源性神经营养因子 (BDNF)表达水平明显下降 ,给予 17β 雌二醇 (2 .4或 4 .8μg·d- 1,sc ,连续 12周 )替代具有明显的改善作用 (P <0 .0 1)。但卵巢切除及 17β 雌二醇替代对海马内神经营养因子 3表达水平无明显影响。结论　海马内BDNF表达水平的改变与雌激素缺乏具有密切关系。雌激素对调节海马内BDNF水平具有重要作用。     

重组人骨形态发生蛋白-7体内外生物学活性研究

采用体外、体内两种方法同时测定原核表达重组人BMP 7(rhBMP 7)的生物学活性 ,建立rhBMP 7活性测定的标准并为推广其临床应用提供依据。在体外 ,PNPP底物比色法和MTT比色法结果表明 ,10倍、10 0倍稀释上清组与细胞共同培养 72h后碱性磷酸酶 (ALP)水平和活细胞增殖数明显高于阴性对照组 (P <0 .0 5 ) ,而与标准品无显著性差异 (P >0 .0 5 )。在体内 ,将rhBMP 7植入小鼠肌间隙后 3周 ,见软骨岛和编织骨生成 ;而将rhBMP 7与胶原载体复合后植入 ,可见大量骨小梁、骨髓腔和板层骨 ,血管和骨髓丰富 ;成骨率均为8/ 8。ALP水平和钙含量 ,rhBMP 7组与标准品组相比 ,无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;复合组则明显高于单独植入rhBMP 7和胶原两组 (P <0 .0 5 )。     

诺和笔3及基因重组人胰岛素的应用

笔者于2003年起应用诺和笔3(胰岛素注射笔)及基因重组人胰岛素(诺和灵笔芯)，共治疗80名糖尿病患者，现将应用中的一些体会报道如下：     

具神经营养活性的小分子化合物

神经退行性疾病是危害老年人健康的疾病之一，天然非肽类小分子有望成为新的神经营养药物。从来源、结构特点、生物活性等方面，对近年来发现的具有神经营养活性的非肽类小分子化合物的研究状况做简要综述。     

白藜芦醇对脑缺血小鼠BDNF及NT-3表达的影响

目的探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)预处理对局灶性脑缺血小鼠的神经保护作用。方法将72只SPF级♂昆明小鼠随机分为假手术组、模型组、溶剂治疗组、白藜芦醇预治疗组,每组各18只。线栓法制作小鼠大脑中动脉永久性脑缺血模型(permanent middle cerebral artery occlusion,pM-CAO),免疫组织化学法检测脑组织BDNF及NT-3蛋白的表达,RT-PCR技术检测缺血脑组织中BDNF及NT-3的基因水平,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测脑梗死体积的变化,以Zea Longa评分法进行神经功能学评分。结果与模型组及溶剂治疗组相比,白藜芦醇预治疗组梗死区周围BDNF及NT-3的表达水平均明显升高(P<0.01),脑梗死体积明显缩小(P<0.01),且神经功能学评分明显改善(P<0.01)。结论白藜芦醇可增加脑缺血后BDNF及NT-3的表达,减少脑梗死体积,改善神经功能缺损。     

槲皮素-7-硫酸酯钠盐对重组人肌醇磷脂3-激酶p110β催化亚基的影响

目的观察槲皮素7硫酸酯钠盐(SQMS)对重组人肌醇磷脂3激酶(PI3K)p110β催化亚基的直接作用。方法通过基因工程技术的方法获得PI3Kp110β催化亚基。用PtdIns(4,5)P2,[γ32P]ATP与重组PI3Kp110β催化亚基一起保温的方法测定PI3K的活性;32P标记的磷脂用氯仿和甲醇抽提,加闪烁液于液闪计数仪计数。结果SQMS对重组人PI3Kp110β催化亚基有抑制作用,IC50为1314μmol·L-1。结论SQMS是PI3K的抑制剂。重组人PI3Kp110β催化亚基可作为一种较为简便地筛选和开发有效的PI3K抑制剂的分子靶点。     

双位酶免疫法测定NT-3cDNA-CHO细胞上清中rNT-3含量

目的：定量测定ＮＴ－３ｃＤＮＡ／ＣＨＯ细胞增减上清中基因重组ＮＴ－３的含量。方法：利用的ＮｏＡｂ,建立了双位ＥＩＡ法。结果：该法检测限为５．０ｐｇ／ｍｌ,批内差的系数为６．２％～１１．４％（ｎ＝６）,批间差变异系数为５．４％～８．２％（ｎ＝６）。４株阳性细胞增减上清中有高水平的目的产物。结论：该ＥＩＡ法简单准确;用该法成功筛选到一最高表达基因重组ＮＴ－３的单克隆细胞株。     

重组人酸性成纤维细胞生长因子的稳定性研究

目的研究重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)在不同温度下的存放稳定性。方法rhaFGF冻干粉和溶媒在4,25和37℃分别保存30个月;rhaFGF液体在4℃保存56d,在25和37℃分别保存35d。采用MTT法测定rhaFGF的生物活性,同时进行外观性状、水分含量、pH值的测量和无菌试验。结果4℃时,rhaFGF冻干粉、液体和溶媒的各项性质在观察期内都无变化。25℃时,rhaFGF冻干粉、液体的生物活性分别在存放18个月和35d有下降趋势。37℃时,rhaFGF冻干粉、液体的生物活性分别在存放12个月和35d有下降趋势。结论rhaFGF冻干粉在4℃时可有效保存2年;rhaFGF冻干粉溶解后于4℃时保存28d内使用有效;溶媒在4℃时保存2年质量稳定。     

Immunosuppressive activity of recombinant ILT3

Tolerogenic antigen presenting cells (APC) are characterized by high expression of the inhibitory receptors ILT3 and ILT4. We have engineered ILT3 and ILT4 cytoplasmic deletion mutants (ILT3delta and ILT4delta), which were transfected in the dendritic-like cell line KG1, to investigate ILT3 and ILT4's capacity to signal extracellularly. KG1.ILT3delta, similar to untruncated ILT3, inhibits T cell responses such as proliferation and cell-mediated cytotoxicity. In contrast, KG1.ILT4delta lost the suppressive activity of untruncated ILT4. This indicates that the inhibitory function of ILT4 relies entirely on the cytoplasmic region containing ITIM motifs. We further demonstrated that recombinant soluble ILT3 inhibits T helper and cytotoxic function while inducing the differentiation of CD8(+) Ts cells. Hence, Ts modulate APC function inducing inhibitory receptors, which in turn elicit the generation of Ts.     

重组人骨唾液酸蛋白的纯化及生物学活性研究

目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯化rhBSP。通过羟基磷灰石(HA)晶体生长抑制实验、细胞黏附实验和鸡胚尿囊绒膜实验分析rhBSP的生物学活性。结果纯化的rhBSP达到电泳纯,并能抑制HA晶体生长,可介导乳腺癌细胞黏附和促进血管生成。结论纯化的rhBSP具有良好的生物学活性,可用于进一步研究BSP相关的病理、生理机制。     

地塞米松对恶性造血细胞Flt3受体表达及重组人Flt3配体诱导的细胞增殖的影响

目的:研究地塞米松(DXM)对恶性造血细胞表面Flt3受体表达及重组人Flt3配体(rhFL)介导的恶性造血细胞增殖的影响。方法:采用流式细胞仪分析18株恶性造血细胞系细胞和10例新鲜白血病原代细胞表面Flt3受体的表达,及与DXM 0.1μmol/L共育24h后Flt3受体的表达,用NTT法测定DXM对rhFL介导的恶性造血细胞增殖的影响。结果:(1)恶性造血细胞系细胞和白血病原代细胞Flt3受体的表达广泛并呈多样性。(2)恶性细胞表面Flt3受体的表达与rhFL介导的恶性细胞增殖无一定相关性,rhFL促进部分Flt3受体阴性细胞的增殖。(3)DXM下调Flt3受体的表达,抑制rhFL介导的部分恶性造血细胞系细胞和新鲜白血病原代细胞的增殖。结论:DXM可下调恶性造血细胞表面Flt3受体的表达,抑制rhFL介导的恶性造血细胞的增殖。DXM和rhFL联合应用,可使rhFL在恶性造血系统疾病的造血功能缺乏治疗时更为安全。     

基因重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3融合蛋白在猕猴中的药代动力学

目的　研究重组人粒 /巨噬细胞集落刺激因子 白细胞介素 3融合蛋白 (PIXY32 1)在猕猴中的药动学。方法　12 5I 标记结合反相高效液相和酸沉淀法。结果　 12 5I PIXY32 1纯度为 94 5 % ,标记前后PIXY32 1对TF 1细胞增殖的ED50 分别为 0 12 5和 0 119μg·L-1。12 5I PIXY32 1在体内迅速降解。iv和sc后末端T1/ 2 相近 ,为 6 6～ 8 2h。AUC随sc剂量增大 ,全身清除率ClS 相近 ,sc生物利用度6 3 %± 2 1%。泌尿系统浓度最高 ,胆汁其次 ,骨髓和脾脏高于其它组织略低于血清 ,脑内最低。主要经尿排泄 ,少部分在尿中以原型排出。结论　猕猴sc12 5I PIXY32 12 0～ 80 μg·kg-1后为线性药代动力学。肾脏在12 5I PIXY32 1的降解中起一定作用     

人UGT1A3重组酶催化芹菜素葡醛酸结合反应

目的旨在了解人UGT1A3重组酶与芹菜素的有关代谢及其酶动力学参数,并阐述不同有机溶剂对酶动力学参数测定的影响。方法采用Bac-to-Bac系统表达人UGT1A3重组酶与芹菜素37℃共孵育,用HPLC法测定孵育液中剩余底物浓度,利用Lineweaver Burk法计算酶动力学参数,并进一步进行代谢物的确认。同时考察了用不同有机溶剂溶解底物对酶动力学参数测定的影响。结果采用Bac-to-Bac系统表达人UGT1A3重组酶,测得其催化芹菜素的Km为(28.88±2.47)μmol.L-1,Vmax为(224.19±21.11)nmol.m in-1.g-1,Vmax/Km为(7.75±0.29)mL.m in-1.g-1。不同有机溶剂对酶动力学参数测定无显著影响。结论芹菜素可被人UGT1A3重组酶催化,进行葡醛酸结合反应。     

重组人源化兔抗VEGF单克隆抗体质控方法与质量标准研究

目的:建立重组人源化兔抗VEGF单抗的质控方法和质量标准。方法:利用HUVEC细胞增殖抑制试验测定重组人源化兔抗VEGF单抗的生物学活性;SDS-PAGE和SEC-HPLC测定纯度;胰酶酶切,HPLC测定其肽图;实时定量PCR检测CHO宿主DNA残留量;采用ELISA法分别测定VEGF结合力、残留ProA含量和残留菌体蛋白含量;水平等电聚焦电泳法测定等电点;其余检测项目按中国药典2010年版三部规定进行。结果:用建立的方法对重组人源化兔抗VEGF单抗的原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》和中国药典2010年版三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。