雪旺细胞体外培养和纯化的新方法

目的介绍雪旺细胞体外培养、纯化的新方法。方法用0．25％Ⅳ型皎原酶和0．03％胰蛋白酶消化出生3d的SD鼠臂层神经和坐骨神经组织块40min．再将组织块贴壁培养。然后采用组织块反复种植纯化法、低浓度胰酶快速消化和差速贴壁法对雪旺细胞进行纯化。结果雪旺细胞从组织块中“爬出”速度较直接组织贴壁培养方法快，且纯度可达98％以上，细胞所受到的外界因素影响也较少。结论先用酶消化后组织块贴壁培养雪旺细胞的方法和组织块反复种植纯化、低浓度胰酶快速消化和差速贴壁法综合运用是一种简便有效的细胞培养、纯化方法，值得进一步推广。     

大鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养纯化的实验研究

目的:探索大鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养纯化的方法,以获取大量的雪旺细胞应用于周围神经组织工程研究.方法:取预变性坐骨神经,去神经外膜,剪碎块后,用胰酶及胶原酶组成的混合酶消化15 min,加入含10%胎牛血清的DMEM吹打成悬液进行培养.24 h后将培养液全部吸出,组织块中的细胞游出铺满皿底后,将组织块移入新的培养皿中,反复3次后将得到雪旺细胞扩大培养,加入b-FGF(20 ng/mL),待细胞铺满瓶底的80%～90%时,即可传代.纯化后细胞行S-100免疫细胞化学鉴定.结果:双酶消化法结合差速贴壁法可去除较多杂细胞,应用b-FGF刺激雪旺细胞增殖,可获得大量高纯度的雪旺细胞,经S-100蛋白免疫细胞化学鉴定,雪旺细胞纯度达96%以上.结论:双酶消化法、差速贴壁法结合b-FGF刺激增殖的方法可从坐骨神经中分离纯化大量雪旺细胞.     

人牙周膜成纤维细胞的细胞培养技术

目的人牙周膜成纤维细胞的细胞培养技术两种方法的比较。方法采用组织块法和酶消化法进行人牙周膜成纤维细胞的原代培养,绘制PDLFs的生长曲线。用Envision免疫组化方法进行细胞来源的鉴定。结论组织块培养方法更适合PDLFs的原代培养。     

组织块法和酶消化法培养人牙周膜细胞

目的：作者分别采用酶消化法和组织块法培养人牙周膜细胞，并对这两种方法进行比较。方法：倒置相差显微镜连续观察体外培养的人牙周膜细胞原代和传代生长情况，从形态学、免疫组化及细胞增殖方面对比两种方法培养细胞的异同。结果：两种方法培养的细胞形态大致相同，来源一致，增殖和生长曲线大体一致。组织块法培养的细胞同源性好，但初代培养时间长；酶消化法培养的细胞一次可获得的细胞量大，但容量污染，且初代培养的细胞混有较多的上皮细胞，需多次传代才能去除。结论：组织块法培养HPLFs适用于细胞纯度要求较高的实验，而酶消化法培养HPLFs适用于短期内获得大量细胞的实验。     

人胎儿雪旺氏细胞的体外培养及形态学研究

周围神经损伤和修复一直是临床重视的课题。近年研究表明,雪旺氏细胞(Schwann cell.SC)是维持神经再生微环境最基本的因素,SC能分泌、表达20多种具有生物活性的蛋白质,对神经细胞胞体的营养、轴突的再生、髓鞘的形成起着促进、诱导、调控作用,并产生细胞外基质和细胞粘附分子等。因此,SC培养、SC分泌神经营养蛋白的纯化、实验的种植及临床应用越来越受到重视。为完成自体静脉、人羊膜基底膜、SC和神经生长因子(NGF)的复合体桥接周围神经缺损的实验研究(资料待发表),     

成人及成年大鼠雪旺细胞的体外培养

目的 探讨体外培养成人及大鼠雪旺细胞以获得高纯度细胞的方法.方法 分别用双酶分步消化法、预变性消化法及组织块反复接种法体外培养和纯化大鼠雪旺细胞,比较各种方法的纯度差异.结果 组织块反复接种法所获雪旺细胞纯度为(92.7±8.1)%,高于双酶分步消化法的(35.4±3.6)%及预变性消化法的(37.2±4.5)%(P＜0.01).结论 组织块反复接种法可获得高纯度的雪旺细胞.     

酶消化联合玻片覆盖组织块法用于牙龈上皮细胞原代培养的研究

目的探讨一种快速、便捷、成功率高的牙龈上皮细胞原代培养的方法。方法通过细胞形态观察、免疫组化等方法对比单纯dispase酶消化、玻片覆盖组织块法、dispase酶消化联合玻片覆盖组织块法进行牙龈上皮细胞原代培养的成功率。结果酶消化联合玻片覆盖组织块法原代培养成功率高，细胞成铺路石样生长；单纯酶消化法原代培养成功率低，仅见少量散在细胞；单纯玻片覆盖组织块法成纤维污染严重，成功率仅为30％。结论dispase酶消化联合玻片覆盖组织块法可显著提高牙龈上皮细胞原代培养的成功率。     

自身免疫性、多发性周围神经病患者的免疫球蛋白和银杏制剂对体外培养的SD大鼠雪旺氏细胞生长的影响

目的：明确自身免疫介导的多发性周围神经病患者血清中的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig)是否具有破坏雪旺氏细胞（Schwann cell,Sc)的作用；银杏制剂（Extract of Ginkgo biloba 761,EGb761)在这种情况下是否具有保护Sc的作用。方法：在离体培养的雪旺氏细胞中分别加入正常人和自身免疫性周围神经病患者的Ig、Ig和EGb761的混合液，观察雪旺细胞的形态学变化。结果：正常人的Ig对Sc的生长无影响；患者的Ig对体外培养的Sc的生长有抑制作用。EGb761对Sc的生长无显著影响。结论：自身免疫性周围神经病患者的Ig在补体的参与下对体外培养的Sc有明显的破坏作用。银杏制剂在这种情况下似乎无显著的保护体外Sc继续生长的作用。     

两种猪自体骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的比较猪应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法。方法取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状。结果直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形。结论密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强。     

周围神经移植联合神经营养因子治疗损伤脊髓的实验研究

目的 探讨周围神经移植联合神经生长因子(NGF)和脑源性神经生长因子(BDNF)对脊髓损伤的疗效。方法 用SD大鼠在胸8～胸9平面切除半侧4mm长脊髓制成半切模型，取自体肋间神经桥接脊髓缺损，并在局部持续灌注含NGF、BDNF生理盐水3天。3个月后由结构及功能二方面评价脊髓功能恢复情况。结果 术后3个月试验鼠后肢感觉、运动及运动功能改良Tarlov评分、斜板试验均优于对照组；肋间神经植入区见轴突再生，胶质细胞增生减少，雪旺氏细胞增殖；示踪剂通过植入区的近远端界面；体感诱发电位(SEP)磁刺激运动诱发电位(MEP)大部分恢复；MR示脊髓连续无中断。结论 肋间神经移植 NGF、BDNF能促进神经轴突的生长，抑制胶质细胞增生，在局部使雪旺氏细胞增殖，利于脊髓再生。     

周围神经缺损修复再生的研究进展

周围神经损伤断裂是很常见的创伤性疾患,也是近年来研究颇多的一个领域,神经纤维损伤断裂后,修复目的是为了恢复神经的连续性,使损伤神经的近远端建立营养和诱导关系,从而为神经再生创造良好条件。近年来随着基础研究的不断发展,修复周围神经缺损的方法出现了组织工程技术、细胞移植技术、基因工程技术等,推动了修复周围神经缺损研究的进展。     

3种抗原修复法对免疫组化结果的影响

目的采用微波加热、高温加热和酶消化进行组织抗原修复的免疫组织化学技术，比较三种抗原修复方法暴露抗原之间的区别，寻求最佳的免疫组化方法。方法微波修复组、高压加热组和酶消化组，各组用Envision试剂盒，检测Ki-67、CDla、CD83、CD3、CD4、CD8、CD45RO染色结果。结果三种抗原修复方法有明显差异，高压加热最佳，微波加热其次，酶消化效果最差。结论高压加热组织抗原修复方法经济、操作简单，适合大量标本使用。     

周围神经导管研究与进展

目前,周围神经损伤的修复是临床上显微重建外科的一大难题[1]。对于短距离的神经缺损可采用端-端直接缝合的方法;而对于长距离的神经缺损则需进行神经移植[2]。其中,自体神经移植是临床上用于修复周围神经缺损的“金标准”,但其存在供体来源缺乏、造成供体部位二次损伤或导致供体部位神经感觉功能丧失等缺点;异体神经移植供体来源较广泛,但具有较强的免疫排斥反应[3-4]。随着组织工程学这一交叉学科的迅速发展,人们开始利用组织学和工程学原理及方法制备神经导管代替自体神经进行神经移植,以达到周围神经缺损的修复及功能重建的目的[5]。理想的神经导管应具有以下特征[6]：（1）具有良好的生物相容性和生物降解性,对细胞及周围组织均无不良反应;（2）具有良好的通透性,允许营养物质进入导管内部以保证细胞的增殖和生长,同时,可及时排出代谢产物;（3）具有良好的力学性能和特定的三维空间,能模拟人体细胞外基质（extra-cellular matrix,ECM）的形态和功能作用。现将周围神经导管的研究综述如下。     

人胃癌肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）两种分离诱导培养方法抗肿瘤作用的比较

对人胃癌肿瘤浸润淋巴细胞（TumorInfiltratingLymphocytesTIL），用直接分离和酶消化分离两种方法进行抗肿瘤作用比较，观察到直接法得TIL细胞数低，增殖快，酶消化法得TIL细胞数较多，增殖慢，两种方法制备的TIL细胞抗肿瘤效果无差异。有些肿瘤组织标本，质地坚硬，用直接法得TIL细胞太少，难以满足实验要求，本文认为两种方法合用，可互补其各自不足，是可取的。     

不同原代培养方法培养人牙髓细胞的研究

目的：比较并建立一种操作简单方便的人牙髓细胞原代培养方法。方法：选择因正畸拔除的完整无龋双尖牙,无菌条件下取出牙髓,分别采用组织块法、酶消化法和改良组织块法进行人牙髓细胞的体外原代培养,比较观察三种不同培养方法的成活率、细胞形态和数量,测定生长曲线并进行细胞来源鉴定。结果：三种方法均可从人牙髓组织分离培养获得外胚间充质来源的牙髓细胞,呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。组织块法耗时较长,培养成功率26.7%;酶消化法培养成活率较低,且细胞数量较少,培养成功率仅为13.3%;在改良组织块法中未发现有漂浮的组织块,培养成活率较高为80%。结论：改良组织块法解决了传统组织块法中组织块难以贴壁的问题,简化了操作步骤并具有较高的成功率,是一种科学可行的人牙髓细胞原代培养方法。     

免疫磁珠法结合条件培养基进行低密度条件下的神经元原代培养

目的利用免疫磁珠(IMB)细胞分选技术结合星形胶质细胞条件培养基(A-CM)进行低密度条件下原代神经元培养。方法取新生(24 h)内昆明小鼠取大脑半球,通过机械分离与胰酶消化制备细胞悬液进行原代培养。培养10 d后,利用恒温振荡法去除小胶质细胞等杂细胞,抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞纯度。利用达到纯度要求的细胞培养物制备A-CM。分别取新生(24 h)内昆明小鼠大脑皮质和海马,通过机械分离与胰酶消化制备细胞悬液,经IMB细胞分选获得高纯度神经元,加入A-CM进行低密度条件下神经元的原代培养。观察培养过程中神经元的形态学指标,以抗160 ku神经丝抗体免疫荧光染色鉴定神经元纯度。结果细胞免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞的纯度>95%。小鼠皮质和海马神经元形态学观察与细胞免疫荧光染色结果表明,神经元在低密度培养条件下生长良好,不同发育阶段的形态学特征明显,纯度较高。结论低密度条件下成功培养了小鼠大脑皮质和海马原代神经元。     

一种改进的大脑皮层神经元原代培养方法的研究

目的:建立1种简单、高效的新生乳鼠大脑皮层神经元原代培养的方法。方法:出生12 h以内的SD乳鼠为研究对象,采用胰酶消化和机械分离法相结合制备细胞悬液;在细胞培养过程中,不加入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞生长,而是用2%B27 Neurobasal A medium维持培养。结果:神经元生长良好,形成神经元网络系统;通过神经元免疫组织化学鉴定神经元纯度达90%以上。结论:此方法是获得纯度较高的神经元的1种可靠方法。     

应用组织工程骨-软骨复合组织块修复猪软骨缺损

目的 比较应用组织工程骨-软骨复合组织块与单纯组织工程软骨修复猪膝关节软骨缺损的疗效.方法 用软骨细胞和成骨细胞构建组织工程软骨和组织工程骨,再将两者缝合形成骨-软骨复合组织块.在12只猪双侧股骨内髁负重区制造直径8mm的软骨缺损24个,并均分为组织工程骨-软骨复合组织块修复(A)组、组织工程软骨修复(B)组和空白支架(C)组.6个月后对修复部位行大体观察和组织学观察,免疫组化法检测Ⅱ型胶原的表达,并测定新生软骨的力学性能和糖胺聚糖(GAG)含量.结果 A组缺损区被新生透明软骨修复,新生软骨中的圆形细胞分布均匀.A组缺损区的新生软骨弹性模量和GAG含量高于B组.结论 组织工程骨-软骨复合组织块修复软骨缺损的效果明显优于组织工程软骨.     

消化法培养大鼠脑血管平滑肌细胞

目的建立大鼠基底动脉平滑肌细胞培养的方法。方法取大鼠基底动脉,剪成约0.2mm的小段,用含胶原酶Ⅱ型(0.5g.L-1)、弹性酶(0.15g.L-1)、透明质酸酶Ⅳ-S型(0.5g.L-1)及脱氧核糖核酸酶Ⅰ型(0.1g.L-1)的消化液在37℃消化1h。而后用含20%FCS的DMEM/F12进行培养。结果原代培养3d后细胞可少量贴壁,1wk左右可传代,细胞传代成活率达97%。光镜和免疫细胞化学染色检测第4代细胞纯度为98%。结论与目前国内培养脑血管平滑肌细胞的方法相比,本方法操作简单,培养周期短,细胞纯度高。     

昆明种乳鼠肝细胞原代培养方法的比较研究

目的 通过比较3种昆明鼠乳鼠肝细胞原代培养的方法,探索一种更有效、快捷的原代培养方法。方法 取30只1~3日龄昆明种乳鼠,随机分为3组,分别采用组织块培养法、胰酶消化法、组织块联合胰酶消化法进行肝细胞原代培养,用倒置显微镜观察实验过程中肝细胞的形态及生长情况。结果 3种方法均能进行乳鼠肝细胞的原代培养,其中组织块联合胰酶消化法培养的肝细胞形态学和生物学特性优于其他两种方法培养的细胞。结论 组织块联合胰酶消化法是3种方法中最快速和高效的一种方法,获得的乳鼠肝细胞形态及生物学特性好,为体外建立乳鼠肝细胞实验模型奠定了实验基础。