重组肝素酶I在大肠杆菌中的表达及纯化

优化肝素裂解酶I在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pOFX-T7-SL1中的重组表达条件,结果显示接种6 h(OD600≈2.5)后加入0.25 mmol/L IPTG,在25℃下表达8 h目标蛋白酶活达到最高值1.49×105IU/L。进一步于5 L发酵罐中扩大培养,20 h后最高酶活达到5.55×105IU/L。利用亲和层析分离目标蛋白,肝素裂解酶I的纯度可达到96%,回收率为37.58%,比酶活达到1.12×103IU/mg。肝素裂解酶I的高效表达为大规模利用酶法制备低分子肝素打下了坚实的基础。     

蜂毒肽基因在大肠杆菌中的表达、纯化及初步鉴定

目的通过pGEX-2T原核表达载体表达蜂毒肽。方法将人工合成整合了肠激酶作用位点的蜂毒肽基因,插入载体pGEX-2T,构建蜂毒肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-MEL。重组质粒转化E.coliBL21(DE3)诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,取超声上清,通过GST亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,酶切通过溶血实验检测其溶血活性。结果SDS-PAGE结果显示,表达了相对分子质量约为30 000的融合蛋白,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的29.5%。经Western blot鉴定,表达的GST融合蛋白与GST抗体有强烈的交叉反应,说明成功表达了目的融合蛋白。取超声上清,亲和色谱纯化融合蛋白,纯度为95%。肠激酶切割得到了人工天然蜂毒肽,测定蜂毒肽回收率为80%。结论通过原核表达系统成功表达蜂毒肽,具有和天然蜂毒相同的溶血活性。     

芽孢杆菌腺苷磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及酶学特性

对芽孢杆菌的腺苷磷酸化酶基因deoD在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达条件进行优化。确定在菌体培养的对数生长中期进行诱导,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导浓度为0.05mmol/L,诱导温度为37℃。腺苷磷酸化酶的最适pH为7.0,反应温度为50℃,其底物范围广,对腺苷、肌苷均有催化活性。     

大蒜蒜氨酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

提取大蒜总RNA,经RT-PCR扩增出1 348 bp的成熟蒜氨酸酶基因,克隆到pET-28a(+)载体中,构建带有寡聚组氨酸纯化标签的融合蛋白表达质粒.将重组质粒转化入大肠杆菌,经IPTG诱导后的表达产物大部分为包含体,SDS-PAGE电泳和western blotting结果表明目标蛋白的相对分子质量约5.3×104,占菌体总蛋白的45.1%.含6 mol/L盐酸胍的溶液,经镍亲和色谱纯化和透析复性,每升摇瓶发酵液可得蛋白143.3 mg,得率为13.6%,纯度为97%,蒜氨酸酶的比活力为388 u/mg.     

丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备

用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase，SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB (DE3)进行诱导表达，SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达；对影响可溶性表达的4个因素，即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A₆₀₀)和诱导时间进行了优化。结果发现在宿主菌A₆₀₀达到1.0时加入0.4 mmol·L^-1 IPTG，在20 ℃诱导培养8 h表达的可溶性蛋白量最高，约占细胞总蛋白的35.6%。用Ni²⁺亲和色谱法纯化表达产物，纯化蛋白产率达到12.3 mg·L^-1。将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清，ELISA测定效价为1∶24 300，且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原，获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体，为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础。     

链球菌噬菌体透明质酸裂解酶的异源表达及酶学性质表征

透明质酸酶是一类能降解透明质酸的酶的总称,在生物医药及药物递送等多方面具有重要的应用价值。为了挖掘高活性、高底物特异性及高稳定性的透明质酸酶,对来自链球菌噬菌体的透明质酸裂解酶(HylP)进行了异源表达及酶学性质表征。结果表明HylP由337个氨基酸残基构成,是多糖裂解酶家族16(PL16)新成员,重组HylP可在大肠埃希菌BL21(DE3)中可溶性表达,纯化产率可达到30 mg/L,最适酶活反应条件为40℃、pH 6.0,且在35℃及pH 6.0～7.0的中性条件下较为稳定。HylP专一性作用于透明质酸,比活力为24 u/mg;该酶的米氏常数(K_m)为0.13 mg/mL,催化常数(k_cat)为13.80 s^-1,具有较好的催化活性。链球菌噬菌体来源的HylP具有中温、高特异性、高酶活的特性,在绿色制备功能性低分子透明质酸上有潜在应用价值。     

白细胞相关免疫球蛋白样受体-2的克隆、原核表达及纯化

以人白细胞相关免疫球蛋白样受体-2 (LAIR-2/CD306) cDNA质粒为模板,通过PCR技术获得该蛋白成熟区基因片段,插入表达载体pET28a的多克隆位点,进而将构建的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达,所得重组蛋白以包涵体形式存在,包涵体经变性、复性及亲合色谱分离后获得重组蛋白.     

重组TGF β1在大肠杆菌中的表达、纯化

目的通过pET 43.1原核表达载体,表达重组人转化生长因子β1(human transform growth fac-tor,rhTGFβ1)。方法将人工整合了肠激酶作用位点的TGFβ1,插入到含有NusA蛋白的融合表达载体pET 43.1中。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(+)并用IPTG诱导表达。通过镍柱纯化重组蛋白,用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用肠激酶酶切得到TGFβ1单体。结果 SDS-PAGE结果显示,相对分子质量约为70 000的融合蛋白大部分在上清中表达,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的80%。取超声上清,通过His亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,纯度质量分数为95%。肠激酶切割得到TGFβ1单体,经Western blot检测重组蛋白的免疫原性。结论人转化生长因子β1在大肠杆菌中实现了高效表达,获得了具有免疫原性的重组TGFβ1。     

重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定

目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.     

乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达

目的构建瑞替普酶(rPA)大肠杆菌基因工程菌,优化乳糖诱导表达条件,并获得活性重组蛋白。方法通过PCR扩增得到rPA编码基因,将该基因片段克隆到载体pET40b中,转化E.coli BL21。优化确定乳糖诱导浓度、时间、温度等参数,将诱导表达后获得的菌体细胞通过超声破碎裂解后利用镍柱亲和色谱进行分离纯化,重组目的蛋白经Xa因子切割去除DsbC融合标签后释放获得rPA产物,最后利用纤维蛋白平板法对其溶栓活性进行检测。结果 rPA重组质粒构建成功,利用终浓度30 mmol/L的乳糖于30℃诱导5 h可以获得很好的表达效果,重组蛋白的表达量、可溶性及酶活与IPTG诱导产物基本接近;经纯化后的rPA目的蛋白可表现出明显的溶栓活性。结论本研究为进一步利用大肠杆菌系统表达生产高活性重组rPA提供了一定的参考依据。     

白木香纤维素合酶家族基因的鉴定及表达分析

纤维素合酶(cellulose synthase, CesA)是纤维素生物合成途径中的一类关键酶,在植物生长发育和植物防御反应中有着重要的作用。本研究利用白木香基因组数据库,通过生物信息学手段,对白木香纤维素合酶家族成员及其编码蛋白的理化特性、蛋白保守基序、染色体定位、启动子区域等进行预测分析。系统分析鉴定了21个白木香AsCesA基因,并发现AsCesA蛋白主要分布于质膜,氨基酸数目为390～1 261个,分子质量为43.35～142.58 kD,等电点分布在5.67～8.86,均含跨膜结构域,数目为6～8;系统进化分析表明21个AsCesA分为3个亚组;保守基序分析表明,不同AsCesA蛋白的motif组成有一定差异,但均含有motif2、motif6、motif7和motif10。顺式作用元件分析表明, AsCesA基因家族具有响应植物激素作用、非生物胁迫和生物进程相关的顺式作用元件。分析NaCl诱导不同时刻的白木香愈伤组织的转录组数据,选择了7个具有差异表达的AsCesA并分析其在非生物胁迫下的表达量变化。实时荧光定量PCR结果表明,盐、低温、干旱和重金属胁迫均能不同程度影响白...     

一氧化氮合酶在鼻息肉中的表达及意义

目的　了解一氧化氮 (NO)在鼻息肉组织中分布情况 ,检测一氧化氮合酶 (NOS)在人鼻粘膜和鼻息肉中的表达及其定位情况。方法　应用免疫组化染色方法 (SABC法 ) ,检测 38例鼻息肉和 17例对照组下鼻甲粘膜组织中 3种类型NOS的表达情况。结果　 (1)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在 38例鼻息肉组织的上皮及腺上皮细胞中均有表达 ;在炎症细胞里也有表达 ;在 17例对照组鼻粘膜上皮及腺上皮组织中均无表达 (P <0 0 1)。 (2 )神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)和内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)在 38例鼻息肉组织的上皮及腺上皮细胞中大多数无明显表达 ,少数可见弱阳性表达 ;在 17例对照组鼻粘膜上皮及腺上皮组织中有较强的表达 (P <0 0 1)。结论　 (1)NOS存在于炎症 (如鼻息肉 )和非炎症的人类上呼吸道组织中。 (2 )在鼻息肉组织中主要有iNOS的表达 ;在正常鼻粘膜组织中仅有eNOS的表达。 (3)iNOS可能是鼻息肉病理生理学机制中的诸多因素之一 ,在鼻息肉发生发展中发挥着重要作用     

重组人TNF-α在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究

构建有利于人肿瘤坏死因子α(TNF-α)大量表达及有效纯化的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过密码子优化构建表达质粒pET28-TNF,并将其转化入大肠杆菌,对表达条件进行优化后进行大量表达并通过两轮镍柱亲和纯化获得高纯度重组人TNF-α(rhTNF-α)蛋白。应用Western blot和细胞测活分别检测重组人TNF-α蛋白的抗原性和细胞毒活性。成功构建了重组人TNF-α原核表达载体,并通过表达纯化获得了纯度>95%,具有生物活性(LD50<10 ng/mL)的rhTNF-α蛋白。     

人可溶性sTNFR1及胞膜外区Ig融合基因重组腺病毒的真核表达及功能活性鉴定

目的构建携带人sTNFR1与IgGFc片段融合基因的重组腺病毒,稳定表达并初步鉴定其功能活性在妊娠哮喘炎症机制中的作用。方法将PCR扩增的sTNFR1及IgGFc基因片段先后连接到穿梭质粒pAdTrack-CMV多克隆位点上,酶切线性化后在BJ5183细菌内与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,产生获得的AdE-EGFP-sTNFR1-Ig以脂质体法转染AD293细胞进行病毒包装,以绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度及感染效率。RT-PCR、Western blot实验鉴定细胞内重组腺病毒转录及融合基因与蛋白表达;流式细胞术、ELISA实验分析混合培养上清中转染肥大细胞(MC)激活、调节同基因来源T细胞表达Th2/Treg水平及细胞因子分泌效果;MTT评估转染细胞上清中sTNFR1-Ig对TNF-α介导细胞毒效应的拮抗作用。结果成功构建编码sTNFR1-Ig基因的重组腺病毒载体经酶切和测序鉴定正确,制备的腺病毒在转染细胞中的GFP表达以及CPE效应明显,扩增后的滴度为3.7×1010～4.8×1010pfu/ml,体外感染效率可达90%以上;sTNFR1-Ig基因在mRNA及蛋白水平获得的清晰条带均证实腺病毒包装与扩增成功。表达sTNFR1-Ig的MC诱导T细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平以及IL-12含量均明显升高,CD4+IL-4+Th2细胞水平下调(P<0.05),Th2/Treg所占CD4+T细胞比值下降(P<0.05)。sTNFR1-Ig封闭TNF-α对MC免疫毒性作用的浓度效应明显,而EGFP-MCs与对照细胞上清对TNF-α毒性效应的中和阻断能力不足(P<0.05)。结论携sTNFR1-Ig基因重组腺病毒参与的免疫调控与妊娠期哮喘发生发展密切相关。sTNFR1及IgG-Fc亚基胞膜外区结合的表达和引起免疫耐受的作用研究,为妊娠哮喘发病机制在理论上的新突破,为以sTNFRI-Ig为靶点的妊娠哮喘干预治疗奠定基础。     

重组小鼠CK2α亚基在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

目的　研究重组小鼠CK2α亚基在大肠杆菌中的表达 ,并进行纯化和活性的测定。方法　将已构建成功的小鼠蛋白激酶CK2α亚基cDNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,产物依次进行DE 5 2、P11磷酸纤维素和肝素 Sepharose柱层析分离 ,SDS PAGE银染。结果　重组质粒转化表达菌经IPTG诱导后出现一分子量为 4 2ku蛋白过度表达 ,表达蛋白约占菌体总蛋白的 30 6 %。从2 87mg可溶性蛋白质中得到 4 7mg纯化蛋白。SDS PAGE银染显示纯化的蛋白为单一蛋白带。纯化的CK2α和 β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶。重组的CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致。结论　重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2α亚基     

重组人突变型TNF-α在大肠杆菌中的诱导表达及高效纯化

建立重组人突变型ＴＮＦ－α的纯化工艺,获得ＴＮＦ－α纯品,为下游规模生产打基础。方法：诱导表达重组 ＴＮＦ－α突变体蛋白,用 ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ两步层析结合小范围线性梯度洗脱法纯化。结果：所得重组蛋白的纯度达９８％以上,比活达１．７×１０９ｕ／ｍｇ蛋白,无热原。结论：此纯化方法可对重组ＴＮＦ－α突变体蛋白进行高效快速纯化,易于实现规模化生产。     

重组蛋白A在大肠杆菌中的分泌表达及活性测定

利用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白A的基因序列进行密码子优化,在N端加入L-门冬酰胺酶(L-AsPsII)信号肽简并基因序列使其分泌表达,将全合成的蛋白A基因片段插入到pET-28a载体中,转化入BL21(DE3)。乳糖诱导使其表达,其中80%以上目的蛋白位于胞外,表达量达到375 mg/L,剩余目的蛋白位于周质。将胞外目的蛋白超滤浓缩,通过DEAE阴离子交换剂,一步纯化后得到的蛋白,在SDS-PAGE上显示为约32 k的单一条带,纯度达95%以上。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白A活性较高,能与小鼠、兔及羊IgG抗体高效结合,且沸水煮10 min后仍能保持同IgG结合的活性。     

重组人Hexastatin融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及其纯化

目的构建人Hexastatin蛋白原核表达载体,大量表达并纯化Hexastatin蛋白,为其在体内外的活性研究奠定基础。方法提取人食管癌EC9706细胞总RNA,通过RT-PCR方法扩增人Hexastatin基因,导入pMD18-T载体测序,然后克隆至pMAL-c4x表达载体,IPTG诱导表达,并利用Amylose亲和树脂纯化融合蛋白,产物进行Westernblot鉴定。结果经PCR扩增成功获得了687bp的人Hexastatin基因,测序正确。重组人Hexastatin基因在BL21菌体中获得高效可溶性表达,表达的可溶性蛋白占总蛋白量的24.8%,纯化后的MBP-Hexastatin融合蛋白纯度可达90%,Westernblot证实表达蛋白为目的蛋白。结论人Hexastatin基因克隆、表达及纯化的成功,为进一步在体内外研究其生物活性奠定基础,同时也为肿瘤的生物治疗提供了新的方法。