健康志愿者接种TA-CIN后HPV16 E6和E7特异性T细胞免疫增强

业已证明含 1 6型人乳头瘤病毒( HPV1 6 ) L2、E6和 E7融合蛋白的候选疫苗TA- CIN在动物模型中可引发 HPV1 6特异性细胞毒性 T细胞 ( CTL )、辅助性 T细胞和抗体产生 ,而且 TA- CIN免疫后可有效阻止HPV1 6阳性肿瘤细胞的生长。本文主要介绍TA- CIN的安全性和免疫原性。　　HPV1 6 DNA由 W1 2细胞系分离而得 ,聚合酶链反应特异性扩增 HPV1 6 L2、E7、E6基因 ,将目的基因克隆入 p ET质粒 ,在大肠杆菌表达系统表达融合蛋白 HPV1 6L2 E7E6 ,蛋白经纯化后备用。　　将 4 0名健康志愿者 ( 30男 ,1 0女 )随机分为 4组 :安慰…     

人乳头瘤病毒16、18型E_6和E_7蛋白的重组病毒疫苗对宫颈癌的免疫治疗

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤,其发生与人乳头瘤病毒(HPV),尤其是它的16、18型的感染密切相关。约90％的肿瘤细胞中可有HPVDNA,尤其是HPV16、18型基因外显子6、7(E_6、E_7)编码的两种蛋白的持续表达。这样肿瘤细胞中的E_6、E_7蛋白可作为肿瘤免疫治疗的特异性靶目标。已有若干证据表明E_6、E_7制备的HPV-抗原引导的免疫治疗对实验性和临床的宫颈癌有控制作用,其免疫治疗的主要机理就在于激发了特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的反应。本文作者以重组人乳头瘤病毒16、18型编码E_6、E_7蛋白序列(TA-HPV)的病毒疫苗修饰型为基础,首次在人体上进行了宫颈癌病毒疫苗免疫治疗的临床试验。初步结果表明用此病毒疫苗引起的HPV特异性的免疫反应既安全又有效。     

HPV16 E6/E7重组体DNA免疫对小鼠脾细胞分泌活性的影响

目的研究人乳头状瘤病毒16型（HPV16）E6／E7蛋白与结核杆菌热休克蛋白70（HSP70）表达重组体DNA免疫对小鼠活化脾细胞分泌活性的影响。方法采用肌肉注射DNA的方法免疫小鼠。分离脾细胞。用ELISA检测细胞因子的表达水平及抗体的水平。用RT-PCR的方法检测细胞中细胞因子mRNA的水平。结果以HPV16E6／E7为基础的DNA免疫小鼠后，检测到的细胞因子IL-2，IFNγ的含量明显升高：与结核杆菌HSP70重组后。IL-2，IFNγ的含量较重组前明显升高。与结核杆菌HSP70重组后，IL-10及抗体水平没有明显变化。结论以HPV16E6／E7为基础的DNA免疫能增强小鼠的细胞免疫反应。与结核杆菌HSP70重组后能提高细胞免疫的效果，但对体液免疫几乎没有影响。     

16型人乳头状瘤病毒疫苗研究现状

16型人乳头状瘤病毒(HPV16)感染人类上皮可引起恶性肿瘤.目前正在进行研究的疫苗有两类:一类是核壳蛋白(L1和L2)疫苗,它能诱导机体产生中和抗体,主要用于预防HPV16感染;另一类是E6E7的表位或突变体制备的疫苗,用于HPV16相关肿瘤的治疗.     

单磷酸脂质A佐剂对重组生殖器疣疫苗免疫原性的增强作用[英]

生殖器疣的消退与T细胞免疫有关.作者曾证明重组6型人乳头瘤病毒(HPV6)L2E7融合蛋白吸附于铝胶(Alhydrogel)制成的L2E7/铝胶疫苗的免疫原性强于可溶性L2E7.作者进一步用明尼苏达沙门菌R595株的脂多糖水解脱毒形式单磷酸脂质A(MPL)作为佐剂,研究MPL在不同配方中对L2E7免疫原性和反应原性的影响.     

密码子修饰增强乳头瘤病毒晚期蛋白表达的研究

目的观察密码子修饰对乳头瘤病毒衣壳蛋白基因表达的影响。方法以密码子改变影响乳头瘤病毒晚期蛋白的表达为依据，以人类常用密码子替代野生型密码子构建HPV6b L1(HLl)、HPV6b E7 N-端(HL1E7I)、HPV6b E7 C-端(HL1E7 Ⅱ)和BPV1 L2 （HBL2)质粒，转染真核细胞系，以免疫荧光、免疫印记、电镜、流式细胞分析、ELISA观察相应蛋白表达情况。结果上述质粒在真核细胞均有HpVL1、蛋白的高度表达；HLlE7I表达的L1蛋白定位于细胞质而HL1E7Ⅱ表达的L1蛋白定位于细胞核；密码子修饰后的6HL1和HL1E7基因能有效表达HPV6bL1样的假病毒颗粒。结论HPV6 E7蛋白的羧基端有核定位信号存在，密码子修饰能增加基因的表达效率，可用于目的基因的表达。     

抗HPV11病毒样颗粒单克隆抗体的性质鉴定及初步应用

目的分析和鉴定抗HPV11病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)鼠源单克隆抗体的性质,筛选性质和生物学活性较优的抗体,并初步应用于抗原或疫苗的质量分析。方法分别利用间接ELISA法和Western blot对HPV11的22株单克隆抗体的亚类、与HPV11 VLP的结合能力和构象敏感性进行检测;采用血凝抑制实验对单克隆抗体的血凝抑制活性进行分析;运用基于假病毒的抗体中和实验对单克隆抗体的中和活性进行鉴定,选出中和活性高的单抗进行两两配对,采用双抗夹心ELISA法捕获单抗并筛选合适的配对双抗。结果对22株单抗的性质进行了详细和完整的鉴定,并根据构象敏感性进行排序,筛选出6株型别特异、结合活性强且中和活性高的单抗(2A2、4A1-3、16G7、14A6、9C12和19C7);成功建立了基于单抗的双抗夹心(14A6∶Ag∶9C12-HRP)ELISA定量分析方法。结论获得了较全面的HPV11 VLP单抗性质信息,建立了重组HPV11抗原质量分析的双抗夹心ELISA法,为HPV11抗原的生命周期管理或尖锐湿疣疫苗的研发、工艺优化、产品放行和稳定性研究等提供了技术支持。     

UPLC-MS/MS鉴定重组人乳头瘤病毒L1蛋白C端的氨基酸序列

目的 应用串联质谱技术鉴定重组人乳头瘤病毒L1蛋白C端的氨基酸序列。方法 将C端富含精氨酸和赖氨酸的重组人乳头瘤病毒L1蛋白酶解成合适长度的肽段混合物，运用液质联用技术进行鉴定。结果 分别对6、11、16、18亚型的重组人乳头瘤病毒L1蛋白的C端氨基酸序列进行了分析确证，均与理论序列一致。结论 所用分析方法简单可行，为HPV疫苗的结构表征和质量控制提供了参考和依据。     

HMGB1对HPV16型重组腺病毒载体疫苗免疫效果的影响及机制研究

目的 探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)分子与人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7重组腺病毒载体疫苗免疫效果的关系及机制。方法 通过TC-1细胞移植诱导建立小鼠肿瘤模型,在接种HPV重组腺病毒载体疫苗的同时,给与HMGB1特异性拮抗剂HMGB1 A box注射,开展肿瘤抑制试验、小鼠免疫状态观察、肿瘤相关信号检测等研究。结果 A box蛋白与疫苗联用,即可显著降低模型小鼠HMGB1血清水平,抑制肿瘤组织中NF-kB的mRNA高表达,提高疫苗的抗肿瘤活性。同时,它还可减少IL-4、促进IFN-g产生,使体内免疫平衡由Th2向Th1偏移。虽然A box对于Bax的影响并不显著,但在接种疫苗并注射A box蛋白后,由肿瘤引起的NF-kB、Bcl-2、c-IAP2、VEGF、MMP-9的表达提高、Bax表达降低均得到显著扭转。结论 HMGB1分子可以削弱HPV重组腺病毒载体疫苗的免疫效果,其机制可能是HMGB1在调节免疫平衡状态及控制肿瘤细胞的凋亡、浸润、转移等多层面均能参与并发挥重要作用。     

治疗尖锐湿疣的重组HPV6 L2E7疫苗的免疫原性及安全性

为了评价以Alhydrogel为吸附剂的重组6型人乳头状瘤病毒（HPV6）L2E7融合蛋白疫苗的免疫原性及安全性,作者对42名健康男性志愿者进行了随机、双盲、安慰剂- 对照的Ⅰ期临床试验。将研究对象分为对照组（6人）和3个接种组（每组12人）,分别肌注重组L2E7疫苗3、30及300μg。其中各剂量疫苗组又随机分为两个小组（每组6人）,分别按0、1、4周程序（快速程序）和0、4、8周程序（经典程序）接种疫苗。快速程序组分别于第0、1、4、8和32周采血,经典程序组分别于第0、2、4、8、10和32周采血。通过检测体外L2E7特异性T淋巴细胞增殖应答、γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素5（IL-5）的分泌量及血清抗L2E7抗体评价疫苗的免疫原性。     

检测百日咳黏着素的酶联免疫吸附法的建立及初步应用

 目的  建立定量检测白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产过程中黏着素（pertactin, Prn）的方法。 方法   纯化的Prn免疫家兔以制备高效价血清抗Prn抗体。辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗Prn多克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记,建立双抗体夹心ELISA法。 结果   建立的方法与丝状血凝素和百日咳毒素无交叉反应,特异性较好。该ELISA法在1.25~80 .00 μg/L Prn测量区间有最佳线性,相关系数＞0.99。实验内和实验间检测64、32、16 μg/L Prn,变异系数为2.6%~7.7%,回收率为84.9%~95.5%,精密度和准确度均符合常规质控要求,因此该法的定量限度为16 μg/L。 结论   建立的ELISA法可有效检测百日咳疫苗纯化过程中的Prn含量,为组分百日咳疫苗质量控制奠定了重要基础。     

检测破伤风类毒素的酶联免疫吸附法的建立及应用

目的  建立定量检测白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产过程中破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）的方法。方法  TT免疫家兔以制备高效价血清抗TT抗体。辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗TT多克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记,建立双抗体夹心ELISA法。结果  建立的ELISA法与丝状血凝素、百日咳毒素及白喉类毒素无交叉反应,特异性较好。该ELISA法在0.5~16.00 Lf/L TT测量区间有最佳线性,决定系数＞0.99。实验内和实验间检测14.0、12.0、6.0、3.0和1.5 Lf/L TT,变异系数为4.7%~9.8%,回收率为92.7%~109.0%,精密度和准确度均符合常规质控要求。该法的定量下限为1.5 Lf/L TT。结论  建立的ELISA法可有效检测破伤风疫苗纯化过程中的TT含量,为破伤风疫苗质量控制奠定了基础。     

HPV16载量与新疆维吾尔族宫颈癌关系的研究

目的 探讨不同宫颈病变组织中HPV16E6、E7基因载量与新疆维吾尔族宫颈癌前病变进展的关系;评价实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测HPV在临床的应用价值.方法 收集124例宫颈组织(包括宫颈癌和癌前病)和96例宫颈脱落细胞标本,应用实时荧光定量PCR (FQ-PCR)检测早期基因E6、E7和β-肌动蛋白的拷贝数,分析病毒载量.结果 ①β-肌动蛋白阳性标本中,正常对照组、宫颈炎组、CIN组和宫颈癌组HPV16 E6阳性率分别是3.29％、93.3％、75.7％和83.1％;E7阳性率分别是64.8％、86.6％、81％和100％,E6/E7的检出率随宫颈病变严重程度升高,但宫颈癌、CIN、宫颈炎3组之间E6/E7阳性率无显著性差异(x2=0.66,P＞0.05; x2 =0.08,P＞0.05).②HPV16 E6载量(均数±标准差)在正常对照:0.00068±0.00、CINⅠ:1.12±1.98、CINⅡ:0.69±1.02、CIN Ⅲ:3.22±7.86、宫颈癌:2.83±4.59.不同病变组病毒载量分布差异有统计学意义(P＞0.01),与病变严重程度相关(r=0.83,P＜0.01).③HPV16 E7载量(均数±标准差)在正常对照:1.80±5.86、CINⅠ:2220±3894、CIN Ⅱ:11340±21848、CINⅢ:7908±1.02、宫颈癌:9194±20478.各级病变载量分布差异有统计学意义(P＞0.01),与病变严重程度相关(r=0.754,P ＜0.01).结论 采用FQ-PCR检测宫颈组织HPV16 E6/E7结果显示,病毒载量与新疆维吾尔族妇女宫颈病变程度高度相关,其病毒载量可能是预测宫颈病变的理想指标;FQ-PCR方法检测宫颈病变中HPV DNA载量,具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点,对宫颈癌的普查和治疗有指导意义.     

A non-pathogenic live vector as an efficient delivery system in vaccine design for the prevention of HPV16 E7-overexpressing cancers

Abstract

The attenuated or non-pathogenic live vectors have been evolved specifically to deliver DNA into cells as efficient delivery tools in gene therapy. Recently, a non-pathogenic protozoan, Leishmania tarentolae (L.tar) has attracted a great attention. In current study, we used Leishmania expression system (LEXSY) for stable expression of HPV16 E7 linked to different mini-chaperones [N-/C-terminal of gp96] and compared their immunogenicity and protective effects in C57BL/6 mice against TC-1 challenge. TC-1 murine model is primary C57BL/6 mice lung epithelial cells co-transformed with HPV16 E6, HPV16 E7 and ras oncogenes. Our results showed that subcutaneous administration of mice with both the recombinant L.tar-E7-NT (gp96) and L.tar-E7-CT (gp96) led to enhance the levels of IFN-γ and also IgG2a before and after challenge with TC-1. Furthermore, L.tar-E7-CT (gp96) live vaccine indicated significant protective effects as compared to control groups as well as group vaccinated with L.tar-E7. Indeed, the recombinant live vector is capable of eliciting effective humoral and cellular immune responses in mice, but however, further studies are required to increase their efficacy.     

HPV E6/E7 mRNA检测对宫颈细胞学诊断为ASC-H的分流作用

目的 HPV E6/E7 mRNA检测对宫颈细胞学诊断为ASC-H的分流作用。方法对68例ASC-H患者进行HPV E6/E7 mRNA及高危型HPV检测,并行阴道镜检查及活检,分析其结果之间的关系。结果 HPV E6/E7 mRNA方法检出ASC-H中CIN2+宫颈病变的敏感性为63.2%,特异性为75.5%,阳性预测值为50%,阴性预测值为84.1%。HPV E6/E7 mRNA方法的特异性及阳性预测值明显高于高危HPV方法。结论 HPV E6/E7 mRNA可以作为ASC-H患者是否需要阴道镜检查的一个分流指标。     

The humoral response to Gardasil over four years as defined by total IgG and competitive Luminex immunoassay

Safe and effective vaccines against anogenital human papillomaviruses (HPV) are now available. These vaccines, composed of virus-like particles (VLPs) made from the L1 major capsid protein of specific HPV types, induce a polyclonal antibody response directed against specific conformational and linear epitopes displayed on the VLP. Numerous studies indicated the importance of neutralizing antibodies in protection from infection. However, our understanding of the antibody responses to these vaccines is not complete, and there is no established immune correlate of protection nor antibody threshold that correlates with protection against HPV infection or disease. In the current study, antibody responses of young women to Gardasil?, the quadrivalent HPV 6, 11, 16 and 18 L1 VLP vaccine (qHPV), were assessed through 48 months (M) in total IgG and competitive Luminex immunoassays (total IgG LIA and cLIA). The total IgG LIA was developed as a research assay to evaluate preclinical multivalent HPV VLP vaccine formulations. The cLIA simultaneously evaluates the antibody response to a unique conformational, neutralizing epitope on each of the four HPV types present in the quadrivalent vaccine; HPV 6, 11, 16 and 18. The same sera from women vaccinated with the qHPV vaccine were tested in both the total IgG LIA and the cLIA assays. The proportion of vaccinated women achieving seropositivity and the anti-HPV VLP total IgG and cLIA geometric mean titers (GMTs) were summarized at M7, M24, M48 based on the serostatus cut-points defined for each immunoassay. Overall, greater than 99% of subjects seroconverted to all four vaccine types in both assays; GMTs peaked at M7. For all four HPV types, regardless of the immunoassay used, the most significant decline in GMTs was observed between M7 and M24. By M24, the antibody titers had reached a plateau and minimal declines in antibody titers were observed between M24 and M48 for all four HPV types in both immunoassays. Testing the same sera, seropositivity for M48 HPV18 remained high (96.7%) in the total IgG LIA, but was 64.8% in the cLIA. The current study illustrates potential important differences in serologic assays utilized in the clinical trials of the two currently available HPV VLP vaccines (quadrivalent and bivalent). Differences in seropositivity status are attributed to the measurement parameters and sensitivity of the individual immunoassays and do not indicate reduced anti-HPV18 protective antibodies.     

高危型人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA在宫颈CIN2+病变筛查中的应用价值

目的 探讨高危型人乳头状瘤病毒（HR-HPV）E6/E7 mRNA在子宫颈上皮内瘤变中度及以上（CIN2+级）病变筛查中的临床应用价值。方法 选取2016年6月至2017年6月在北京市垂杨柳医院因接触性阴道出血或疑似宫颈病变妇科门诊就诊的患者307例,均行液基薄层细胞检查（TCT）、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA的检测,并行阴道镜检查及活检。以病理结果为金标准,将病检结果为高级别鳞状上皮内病变（HSIL,包括CIN2和CIN3）或宫颈鳞癌或宫颈腺癌的71例患者作为观察组,记为CIN2+;将病检结果正常和低级别鳞状上皮内病变（LSIL,包括CIN1）的236例患者作为对照组,记为CIN2-。分析TCT、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA的灵敏度和特异度差异。结果 HPV E6/E7mRNA及HPV DNA对CIN2+诊断的特异度分别为79.66%及19.49%,差异有统计学意义（P<0.05）。HPV E6/E7mRNA联合TCT及HPV DNA联合TCT检测对CIN2+诊断的特异度分别为82.63%及35.17%,差异有统计学意义（P<0.05）。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA在筛查CIN2+的ROC曲线下面积分别为0.8420和0.5693,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 HPV E6/E7 mRNA较HPV DNA检测筛查宫颈CIN2+的病变效果更好,HPVE6/E7mRNA联合TCT检测能够提高对CIN2+的病变筛查的特异性。     

Human papillomavirus quadrivalent (types 6, 11, 16, 18) recombinant vaccine (Gardasil)

Human papillomavirus (HPV) quadrivalent recombinant vaccine is a mixture of virus-like particles derived from the L1 capsid proteins of HPV types 6, 11, 16 and 18. It is administered intramuscularly in a three-dose regimen, with the initial injection followed by subsequent doses at months 2 and 6. The vaccine is indicated for use in the prevention of cervical cancer, vulvar and vaginal precancer and cancers, precancerous lesions and genital warts associated with HPV types 6, 11, 16 or 18 infection in adolescents and young women. The quadrivalent vaccine has demonstrated good immunogenicity in young women (16-26 years) and male and female adolescents (aged 9-15 years), inducing high and persistent anti-HPV antibody titres. In a randomised phase III trial designed to bridge efficacy in young women to adolescents (using immunogenicity as a surrogate), the quadrivalent HPV vaccine in adolescents was at least as immunogenic as that in young women. In randomised, double-blind, placebo-controlled trials in >20 000 young women (aged 16-26 years), the vaccine was highly effective in preventing cervical dysplasia of any grade and external genital lesions related to HPV types 6, 11, 16 and 18 infection. These women were followed up for an average of 2 years.black triangle The vaccine was well tolerated, with injection-site reactions and fever being the most common vaccine-related adverse events.     

检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒的建立及应用研究

目的  建立特异、敏感的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒。方法  采用大肠杆菌菌体蛋白免疫家兔,制备得到高效价抗菌体蛋白抗血清。将经饱和硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和亲和层析纯化的兔抗大肠杆菌菌体蛋白特异性多克隆抗体作为包被抗体和检测抗体,用生物素标记检测抗体,并加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素。结果　建立的大肠杆菌菌体蛋白夹心ELISA检测方法的敏感性为0.32 μg/L,检测范围为1~100 μg/L,与国际同类商品化试剂盒相当。此法具有良好的稳定性,其批内变异系数小于7.7%,批间变异系数小于6.2%。结论  建立了特异、敏感、稳定的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒,为生物制品中残留大肠杆菌菌体蛋白的质量控制提供了一种重要的检测方法。