海洋放线菌Streptomyces costaricanus SCSIO ZS0073中fungichromin生物合成基因簇的分析鉴定

目的 对分离自我国广西红沙红树林湿地公园的放线菌菌株Streptomyces costaricanus SCSIO ZS0073进行基因组测序分析,并对其生产的制霉色基素(fungichromin)的生物合成基因簇进行分析鉴定。 方法 对S. costaricanus SCSIO ZS0073菌株进行基因组提取,利用Highseq4000和PacBio SMRT技术相结合的手段对该菌株进行了基因组完成图测序;利用生物信息学方法对基因组进行注释并寻找fungichromin的生物合成基因簇,对fungichromin生物合成骨架基因fgmJ1进行置换突变,确定fungichromin生物合成基因簇,结合fungichromin结构特征和其基因簇内遗传信息及聚酮化合物的生物合成原理,对其生物合成途径进行推测。 结果 全基因组测序发现S. costaricanus SCSIO ZS0073菌株基因组含有一条线性染色体和一个圆形质粒,基因组含有36个次级代谢产物生物合成基因簇。利用基因敲除手段对fungichromin的生物合成基因簇进行了确认并进行了生物合成途径推导。 结论 fungichromin生物合成基因簇的确定和生物合成途径的推导为该化合物的基因工程改造研究奠定了分子基础。     

一株海洋来源Streptomyces sp. SCSIO 1682中那西肽(nosiheptide)的分离鉴定及其生物合成基因簇分析

目的 对一株海洋来源的菌株SCSIO 1682进行16S rDNA分子生物学鉴定,对发酵产物中的抑菌活性化合物进行分离鉴定,并对抑菌活性化合物的生物合成基因簇进行分析。方法 通过构建基于16S rDNA序列的系统发育树来进行菌株鉴定;通过有机溶剂萃取、正相和反相硅胶层析等化学分离手段对菌株SCSIO 1682的次级代谢产物进行活性追踪分离纯化;运用HR-ESI-MS,₁H和₁₃C NMR等波谱手段对所得化合物进行结构解析;通过对菌株SCSIO 1682进行全基因组扫描测序鉴定所得化合物的生物合成基因簇。结果 该菌株被鉴定为Streptomyces sp. SCSIO 1682,所得抑菌活性化合物为那西肽,鉴定了那西肽的生物合成基因簇并进行生物信息学分析。结论 从海洋链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 1682中分离鉴定了那西肽,那西肽生物合成基因簇的鉴定为利用组合生物合成和合成生物学技术对那西肽进行结构改造提供了新的基因资源。     

海鞘来源放线菌Streptomyces pratensis SCSIO LCY05中skyllamycins的发现及其生物合成分析

目的 挖掘海鞘来源放线菌Streptomyces pratensis SCSIO LCY05生产含肉桂酰独特结构单元的skyllamycins类环肽的潜能,并深入分析skyllamycins生物合成基因簇的新特征。方法 利用Illumina Hiseq和Pacbio SMRT测序平台对S. pratensis SCSIO LCY05基因组DNA其进行全基因组测序,通过生物信息学手段对菌株基因组的生物合成基因簇进行预测和基因功能注释,采用OSMAC (one strain many compounds) 策略对S. pratensis SCSIO LCY05菌株进行发酵优化,结合萃取法、色谱学和波谱学等方法对该菌株的次级代谢产物进行分离和结构鉴定,并对得到的化合物的生物合成途径进行推导及对新颖的合成特征进行挖掘。结果 全基因组测序结果表明,S. pratensis SCSIO LCY05菌株的基因组全长为8.42 Mbp,共含有35个生物合成基因簇,该基因组上的基因簇20与skyllamycins生物合成基因簇的相似度为95%。在OSMAC策略的优化基础上,发现S. pratensis SCSIO LCY05菌株在SCAS培养基中出现了两个具有典型吸收特征的峰,经鉴定为skyllamycin A和skyllamycin B环肽化合物,并推导了其生物合成途径。进一步的聚类分析发现skyllamycins装配线上的C₁₁结构域可能是具有缩合和异构化双重功能的结构域,负责skyllamycins中第11个氨基酸的组装和异构化。结论 本研究不仅发现海鞘来源放线菌S. pratensis SCSIO LCY05经OSMAC策略的优化后可产生skyllamycins类环肽化合物,并揭示了skyllamycins生物合成过程中的新特征,同时也为skyllamycins类化合物生物合成机制的深入阐释及其进一步的开发利用提供了新的菌株资源。     

宁夏枸杞根际土壤链霉菌V-1-3次级代谢产物分析

摘要：目的 获得链霉菌V-1-3的基因组序列信息,分析其次级代谢产物生物合成基因簇并预测其代谢产物,为发现潜在新抗生素奠定基础。方法 基于16S rRNA基因序列进行菌株属水平鉴定,利用Illumina HiSeq+PacBio测序技术对菌株V-1-3进行基因组测序,采用antiSMASH(v6.0.1)在线工具分析次级代谢产物生物合成基因簇,液-质联用技术检测产生的次级代谢产物。结果 链霉菌V-1-3基因组序列全长8 243 417 bp,平均(G+C)含量为72.14 %,共编码7578个基因,预测到33个生物合成基因簇,利用液-质联用检测到4个代谢物：oxalomycin B、geosmin、coelichelin和ishigamide。结论 来自盐碱地的链霉菌V-1-3具有丰富的次级代谢产物生物合成基因簇,能产生多种次级代谢产物,具有进一步发掘新抗生素的价值。     

深海链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 04777中肠道菌素的分离鉴定

目的对从印度洋深海沉积物中分离的1株深海放线菌Streptomyces sp.SCSIO 04777进行鉴定并对其抗菌活性次级代谢产物进行研究。方法通过16SrDNA序列分析并构建系统发育进化树来鉴定菌株,利用有机溶剂萃取、正相和反相硅胶层析等分离手段对海洋放线菌SCSIO 04777的发酵产物进行分离纯化,通过波谱数据分析并参阅文献对化合物进行结构鉴定。结果该放线菌被鉴定为Streptomyces sp.SCSIO04777,并从其发酵产物中分离鉴定了芳香聚酮类化合物-肠道菌素。结论首次筛选得到了1株产生肠道菌素的深海链霉菌,为肠道菌素的开发利用提供了新的菌株资源。     

雷帕链霉菌次级代谢产物及其生物合成的研究进展

摘要：雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus)是一种重要的工业菌株,主要用于生产新型大环内酯类抗生素——雷帕霉 素。该抗生素具有抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制和抗衰老等众多生物活性,临床上主要用作器官移植的免疫抑制剂以及抗肿瘤药 物。全基因组测序表明,雷帕链霉菌野生型菌株NRRL5491基因组全长12.7Mb,编码多达48个次级代谢产物生物合成基因簇(共 长达3Mb),证明其具备强大的次级代谢潜力。除雷帕霉素以外,至今已有多种活性天然产物被鉴定,包括放线菌酸、尼日利亚 菌素、洋橄榄叶素、安莎类抗生素和六烯类抗生素等,相关合成基因簇及其生物合成途径已被解析。本文将就雷帕链霉菌中各 种次级代谢产物的生物学功能、生物合成基因簇及其生物合成过程等研究进展进行总结梳理,并就如何更好挖掘雷帕链霉菌中 的活性天然产物进行简单展望与讨论。     

湖泊放线菌SIIA-A16124的分类鉴定及基因组挖掘

目的 对湖泊放线菌SIIA-A16124进行分类鉴定和基因组挖掘。方法 采用多相分类法对菌株的形态学、生理生化、细胞壁化学组分、16S rRNA基因序列进行测定和分类鉴定,采用基因组挖掘分析生物合成基因簇,经发酵培养、抗菌活性检测及活性产物质谱分析,推测其活性产物的化合物结构类别。结果 菌株SIIA-A16124的16S rRNA基因与菌株Actinokineospora inagensis NRRL B-24050T同源性最高为99%;菌株SIIA-A16124在ISP3培养基上中等产孢和水解淀粉的特性与模式菌株存在明显差异;鉴定菌株SIIA-A16124为动孢菌Actinokineospora sp.,具有羊毛硫肽生物合成基因簇,其活性次级代谢产物属于羊毛硫肽类抗生素。结论 首次发现动孢菌属放线菌具有生物合成羊毛硫肽类抗生素的能力。     

玫瑰孢链霉菌基因组挖掘研究进展

玫瑰孢链霉菌是重要抗生素达托霉素的产生菌。基因组挖掘发现该菌具有丰富的次级代谢产物合成潜力,激活沉默次级代谢产物生物合成基因簇,发现了10多种具有多种生物活性的次级代谢产物。本文回顾了玫瑰孢链霉菌次级代谢产物的研究进展,以及激活这些沉默生物合成基因簇的研究策略。这些研究为其他链霉菌基因组挖掘提供了有效的思路和方法学参考。     

海洋来源放线菌Streptomyces sp. SCSIO BEMM34的次级代谢产物研究

摘 要:目的 对一株来源于南海沉积物的放线菌Streptomyces sp. SCSIO BEMM34进行菌种鉴定及次级代谢产物研究。方法 通过16S rDNA序列分析并构建系统发育进化树来鉴定菌株,利用硅胶、凝胶层析,半制备高效液相分离等手段对海洋放线菌SCSIO BEMM34的发酵产物进行分离纯化,通过波谱数据分析及文献比对的方法对分离纯化得到的化合物进行结构鉴定,采用滤纸片法进行抗菌活性测试。结果 从一株海洋来源放线菌中分离得到2个戊二酰亚胺类化合物1和2,以及一个酚酸类化合物3。抗菌活性测试结果表明,化合物1-3都没有明显的抑菌活性。     

红树林放线菌抗沃柑病原真菌的研究

摘要：目的 分离鉴定沃柑叶斑病害中的病原真菌,并从广西红树林来源放线菌中筛选高效抑制病原真菌的菌株,为开展沃柑真菌病害的防治奠定基础。方法 采用组织分离法对病原真菌进行分离和纯化培养,通过形态学、ITS基因序列分析及构建系统发育树相结合的方法对病原真菌进行鉴定,并按照柯赫氏法则对健康沃柑叶片进行回接验证。采用平板对峙法对24株红树林放线菌进行抑菌活性初筛,并检测活性菌株发酵产物的抗菌活性及防病害效果。通过antiSMASH对目标菌株的基因组序列进行分析,预测其合成次级代谢产物的能力。结果 从沃柑叶斑病害中分离出4种植物病原真菌,其中大豆茎点霉(Boeremia exigua)和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)可导致沃柑叶片出现叶斑病症;从24株放线菌中筛选到1株链霉菌M2020,其对4种病原真菌C1~C4表现出很好的抑菌活性,且其发酵产物在沃柑真菌病害(真菌C4侵染)防治试验中效果显著;菌株M2020基因组中含有38个负责聚酮类、非核糖体多肽类和萜烯类等次级代谢产物生物合成的基因簇。结论 致使沃柑出现叶斑病症的病原真菌至少有大豆茎点霉和腐皮镰刀菌,链霉菌M2020具有防治沃柑叶斑病害的潜力。     

深海放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652遗传操作系统的建立

目的建立深海放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652菌株的遗传操作系统,通过基因阻断研究次级代谢产物的生物合成途径。方法在对该菌株的全基因组进行测序的基础上,以基因组序列中编码非核糖体肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPSs)的基因s102-A和s63-A为目标基因,利用PCR-targeting介导的基因置换技术构建了重组质粒,在加有3%海盐的培养基上,通过ET12567/pUZ8002属间接合转移导入SCSIO 00652野生菌。结果接合子通过一代、二代松弛培养都无法得到双交换突变菌株,松弛培养四代后经抗性筛选,双交换率明显提高,PCR分析结果显示s102-A基因和s63-A基因均被成功阻断,HPLC分析结果显示突变株的发酵产物与野生型菌株有一定的差异。结论成功建立了深海放线菌M.thermotolerans SCSIO 00652的遗传操作系统,为对其它基因进行遗传学操作奠定了基础。     

锡林郭勒盟高原盐湖放线菌资源勘探及抗菌活性筛选

摘要：目的 探究锡林郭勒盟高原盐湖放线菌的多样性、新颖性及抗菌活性,为新型抗菌活性产物的发掘储备菌种资源。方 法 采用20种分离培养基,以平板涂布法分离放线菌;依据16S rRNA基因的同源性对菌株进行分子鉴定;PCR检测代表菌株的I型聚 酮合酶(PKS I)、II型聚酮合酶(PKS II)和非核糖体多肽合成酶(NRPS)功能基因;菌株的发酵液上清和菌体分别经乙酸乙酯和丙酮提取, 提取样品经纸片扩散法进行抗菌活性检测。目标菌株合成次级代谢产物的能力通过antiSMASH对基因组序列进行分析预测。结果 从 7份盐湖土壤样品中分离获得了365株放线菌,其分布于放线菌纲的8个目15个科28个属,优势菌属为链霉菌属和拟诺卡菌属。分离获 得的链霉菌新颖性突出,13株链霉菌与近缘菌株16S rRNA基因的最高相似度≤98.0%,推测其归属于10个链霉菌属新种。受试放线菌 对革兰阳性菌的抗菌活性显著,并从中筛选出3株抗菌作用强且抗菌谱较广的链霉菌;20株受试放线菌同时含有3种抗生素生物合成基 因。菌株XMNu-295基因组含有24个潜在的次级代谢产物生物合成基因簇,以聚酮类、非核糖体多肽类和萜烯类等为主。结论 锡林 郭勒盟高原盐湖中可培养放线菌多样性较为丰富,新颖性突出,目标菌株值得进一步开展次级代谢产物的化学研究。     

海洋链霉菌Streptomyces parvus SCSIO Mla-L010中大环内酰胺类抗生素vicenistatin的糖基定向改造

目的 利用海洋链霉菌Streptomyces parvus SCSIO Mla-L010中糖基转移酶的底物宽泛性对vicenistatin进行糖基定向化改造。方法 采用组合生物合成技术分别将其它糖苷类天然产物生物合成途径中的糖基合成基因导入到SCSIO Mla-L010菌株中,构建糖基合成基因异源表达重组菌株;以有机溶剂萃取重组菌株发酵产物并利用现代色谱分离技术进行化合物纯化,进一步使用质谱、核磁共振光谱技术鉴定所获化合物的结构。结果 将streptolydigin、grincamycin和lobophorin生物合成途径中合成D-olivose、L-rhodinose和L-digitoxose糖基的基因导入到SCSIO Mla-L010菌株中,构建了3株异源糖基合成基因重组菌株,并从中分离得到4个含有不同糖基的新vicenistatin类天然产物。结论 不仅丰富了糖苷类天然产物结构库,为海洋药物的研发提供化学实体,还为利用糖基转移酶的底物宽泛性对其它天然产物进行糖基定向改造提供参考和借鉴。     

利普斯他汀高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA的全基因组测序与分析

摘要：目的 解析利普斯他汀(lipstatin)高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA (S. toxytricini AP617-N12CA)的基因组序列信息,为深入研究该菌株高产lipstatin的分子机理与调控机制奠定基础。方法 联合应用三代单分子测序技术和二代高通量测序技术对AP617-N12CA菌株进行全基因组测序,使用相关软件对测序数据进行进基因组组装、基因预测和功能注释,并对lipstatin及其他次级代谢产物生物合成基因簇进行分析预测。结果 AP617-N12CA菌株整个基因组大约6.99Mb,GC含量73.76%,含有6134个编码序列;基因组由一条长约6.38Mb的线型染色体和一个长约0.61Mb的线型质粒组成;同时预测得到22个次级代谢产物合成基因簇,其中lipstatin基因簇定位在线型质粒右臂区域而非在染色体上。结论 首次完成了AP617-N12CA菌株全基因组完成图绘制,在S. toxytricini菌中首次发现和描述了线型质粒,在线型质粒上定位并鉴定分析了lipstatin基因簇。为S. toxytricini的功能基因组学研究和lipstatin高产机理解析提供了基础数据,对后续相关研究具有重要意义。     

The biosynthetic gene clusters of aminocoumarin antibiotics

Plants and microorganisms are the most important sources of secondary metabolites in nature. For research in the functional genomics of secondary metabolism, and for the biotechnological application of such research by genetic engineering and combinatorial biosynthesis, most microorganisms offer a unique advantage to the researcher: the biosynthetic genes for a specific secondary metabolite are not scattered over the genome, but rather are clustered in a well-defined, contiguous region - the biosynthetic gene cluster of that metabolite. This is exemplified in this review for the biosynthetic gene clusters of the aminocoumarin antibiotics novobiocin, clorobiocin and coumermycin A (1), which are potent inhibitors of DNA gyrase. Cloning, sequencing and analysis of the biosynthetic gene clusters of these three antibiotics revealed that the structural differences and similarities of the compounds are perfectly reflected by the genetic organisation of the biosynthetic gene clusters. The function of most biosynthetic genes could be identified by gene inactivation experiments as well as by heterologous expression and biochemical investigation. The prenylated benzoic acid moiety of novobiocin and clorobiocin, involved in the interaction with gyrase, is structurally similar to metabolites found in plants. However, detailed investigations of the biosynthesis revealed that the biosynthetic pathway and the enzymes involved are totally different from those identified in plants.     

Cloning, characterization and heterologous expression of a polyketide synthase and P-450 oxidase involved in the biosynthesis of the antibiotic oleandomycin

The gene cluster encoding the deoxyoleandolide polyketide synthase (OlePKS) was isolated from the oleandomycin producing strain Streptomnyces antibioticus. Sequencing of the first two genes encoding OlePKS, together with the previously identified third gene revealed an overall genetic and protein architecture similar to that of the erythromycin gene cluster encoding the 6-deoxyerythronolide B synthase (DEBS) from Saccharopolyspora erythraea. When the entire OlePKS (10,487 amino acids) was expressed in the heterologous host Streptomyces lividans, it produced 8,8a-deoxyoleandolide, an aglycone precursor of oleandomycin. The role of the P-450 monooxygenase, OleP, in oleandomycin biosynthesis was also examined in vivo by co-expression with DEBS in S. lividans. The production of 8,8a-dihydroxy-6-deoxyerythronolide B and other derivatives indicates that OleP is involved in the epoxidation pathway of oleandomycin biosynthesis. Since there are currently no genetic systems available for manipulation of the natural oleandomycin producing strain, the heterologous expression system reported here provides a useful tool for studying this important macrolide antibiotic.