加压素固相合成方法的研究

建立了一个加压素固相合成的改良法,Ｂｏｃ－Ｇｌｙ柱树脂的方法由钾盐改为盐法,Ｃｙｓ的巯基用ｐＭｅＢｚｌ保护,其他氨基酸侧链均不保护,从而避免了钠／液氨处理。     

Fmoc法固相合成普兰林肽

以Fmoc保护的氨基酸为原料,Amide Rink MBHA树脂为载体,按照氨基酸序列进行耦合制得普兰林肽,同时考察了裂解条件.应用反相高效液相色谱得到纯度98%以上的样品.     

普兰林肽的固相合成

目的:探索普兰林肽的固相合成、氧化条件及纯化方法。方法:采用Fmoc固相多肽合成法,以Rink Amide-AM树脂做载体,HBTU/HOBt/DIEA做缩合剂,逐步缩合得到全保护线性普兰林肽树脂,以TFA/苯甲硫醚/苯酚/H2O/EDT/TIS配比的裂解液脱除保护基团,分别采用空气,二甲基亚砜,双氧水氧化两个半胱氨酸的巯基形成一对二硫键,半制备反相高效液相色谱法纯化。结果:合成含37个氨基酸以及一对二硫键的普兰林肽经RP-HPLC和MALDI-TOF-MS确证,粗品纯度在50.0%以上,粗品经半制备型反相高效液相色谱纯化,所得精肽的纯度大于95.0%,总收率为30.5%。结论:该方法简单,合成的产品成本低,纯度高,可为工业化生产提供借鉴。     

人胸腺肽α1的固相合成及体外活性研究

目的对胸腺肽α1的固相合成工艺进行研究,并对合成产物进行活性评价.方法采用对碱敏感的Nα-芴甲氧羰基(Fmoc)作为α-氨基的保护基,以Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin为起点,逐个延伸固相合成法合成胸腺肽α1.与Nα-Fmoc-基团配套的保护策略还有:叔丁氧羰基(Boc)保护Lys的侧链氨基,叔丁酯基(OtBu)保护Asp、Glu的侧链羧基,叔丁氧基(tBu)保护Ser、Thr的侧链羟基,三苯甲基(Trt)保护Asn的侧链酰胺基.采用DCC-HOBt缩合剂法进行接肽反应,茚三酮定性显色法和水杨醛定量自由氨基检测法控制反应进程,肽段最后用TFA-DCM(V∶V=1∶1)定量地从树脂上切除.结果胸腺肽α1总产率为33.2%.纯化后的产物,经SDS-PAGE和RP-HPLC鉴定,纯度为98.8%以上,活性与日达仙对照品相当.结论 Nα-芴甲氧羰基保护策略的固相合成方法操作简便、条件温和、副反应少,产品纯度高、收率高.     

抗肿瘤肽AP-9的固相合成

建立了抗肿瘤肽AP-9的Fmoc固相全合成方法，产品纯度大于98％。着重研究了Fmoc-Arg（Pbf）-OH与H—Pro—Trt树脂的缩合反应。结果表明，以THF-NMP（1：1）为溶剂，于30℃微波辐射反应6min，缩合产率达80．2％。     

氨甲喋呤-α-肽的固相合成

用固相肽合成法合成了氨甲喋呤(MTX)与MTX-α-苯丙氨酸及精氨酸衍生物,产物不经进一步分离纯化即可达到HPLC单峰,质谱分析其分子量符合理论值。MTX-α-苯丙氨酸经羧肽酶-A处理后,可完全降解为MTX。体外细胞毒性试验,两者活性差异在100倍以上,提示MTX-α-苯丙氨酸是一理想的前体药物。     

肽核酸的固相合成方法

肽核酸（PNA）作为一类很有发展前景的非天然的反义核酸，其高效合成是将其广泛应用的基础。本文从PNA单体的合成和PNA寡聚体的合成两方面对近几年PNA的固相合成作了系统的介绍。     

奥曲肽固相合成工艺研究

目的优化奥曲肽固相合成工艺。方法本研究采用Fmoc保护基固相合成策略合成奥曲肽直链肽[D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol)],并在此基础上进行裂解、成环、纯化、制备奥曲肽。本研究着重对裂解条件进行优化,包括裂解液成分、比例、反应温度和时间等。结果与结论以TFA∶TIS∶H_2O∶DTT=90∶2.5∶2.5∶8为裂解体系,在10℃下反应2～3 h得到纯度92%(HPLC)的直链肽粗品。本文优化的裂解条件提高了奥曲肽直链肽纯度,同时避免了乙二硫醇的使用,使得生产过程对环境更加友好,更适合工业化生产。     

多肽的固相合成

多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义,而且具有重要的应用价值.通过多肽的全合成可以验证一个新的多肽的结构;设计新的多肽,用于研究结构与功能的关系;为多肽生物合成反应机制提供重要信息;建立模型酶,以及合成新的多肽药物等.自Merrifield创立并发展了固相合成多肽的方法,使多肽合成领域取得了重大突破,对化学、生化、医药、免疫及分子微生物学等领域也都起了巨大的推动作用.     

乳糖诱导表达重组人甲状旁腺激素rhPTH(1-34)

目的研究以乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组人甲状旁腺激素的可行性。方法对乳糖浓度、诱导时间及发酵培养方式进行研究,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果 0.6%的乳糖诱导4 h,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白的56.8%,采取分批补料培养方式,5 L发酵罐中蛋白表达量达到42.6%。结论乳糖能作为诱导剂诱导rhPTH(1-34)在大肠杆菌中的表达。     

Solid-phase peptide synthesis using tert.-butyloxycarbonylamino acid pentafluorophenyl esters

Boc-amino acid pentafluorophenyl esters have been successfully used in solid-phase peptide synthesis. The coupling rates and the purity of the products are comparable to those with the symmetrical anhydrides. These active esters require modified Merrifield resin, polar medium for coupling and in some cases, base catalysis.     

Solid-phase peptide synthesis on proteins

A new method for solid-phase peptide synthesis in which a protein is used as the solid support has been developed. Two aspects of the method have been demonstrated. The peptides H-Phe-Leu-Glu-Glu-Val-OH (1) and H-Leu-Leu-Ala-Glj-Val-OH (2), respectively, were synthesized on the amino groups of BSA via a cleaveable linker, using the Fmoc group protecting scheme. The free peptides were obtained by cleavage from the protein with 95% TFA. precipitation in diethyl ether and additional work-up by either dialysis or centrifugation through a membrane followed by gel filtration. The identity of the products was determined by amino acid analysis and HPLC. The peptide-protein conjugates, H-Ser-Met-Asp-Thr-Ser-Asn-Lys-Glu-Glu-Lys-BSA (3) and H-Thr-Val-Leu-BTG (4), were obtained in the same manner, omitting the cleavable linker group. It was found that 35-50 peptide chains were conjugated per molecule BSA and BTG, respectively. Immunization of rabbits with conjugate 3 gave rise to peptide specific antibodies. This method will be useful for generation of sequence specific antibodies, since the peptide is conjugated to the carrier protein exclusively via its C-terminus, and will allow synthesis of highly specific peptide-protein conjugates.     

人甲状旁腺素活性片段前体物Pro-Pro-hPTH(1-34)的制备及活性研究

目的制备出具有生物活性的人甲状旁腺素活性片段类似物,并对其活性进行考察。方法采用基因工程方法:大肠杆菌BL 21为宿主菌,pET 28a为表达载体,天门冬酰胺酶Ⅱ切除信号肽的C末端片段为融合伙伴,在融合伙伴和目的肽结合处引入Asp Pro酸敏感位点及二肽酶Ⅳ识别的N端Pro Pro位点,之后经诱导表达,酸水解使融合伙伴和目的肽分离。结果成功构建了hPTH(1 34)的融合表达体系,它能高效表达含hPTH(1 34)的融合蛋白,经纯化,得到多肽纯品,经鉴定,该多肽的分子量、氨基酸组成均与设计的分子相符,工程菌中用于编码该多肽的DNA片段其测序结果也与原设计相符,是表达该多肽的正确模板。该多肽在Parsons雏鸡分析及卵巢摘除大鼠模型试验中均显示显著活性。结论用基因工程方法成功地制备出人甲状旁腺素活性片段类似物,该产物具有显著生物活性及潜在的药用价值。     

人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白的设计与活性验证

通过对NCBI数据库中不同物种同源序列进行比对protein-protein BLAST,并利用计算机软件DiscoveryStudio3.1进行分子对接和分子动力学模拟,对天然人甲状旁腺激素(1 34)的3个氨基酸R25K26K27进行Q25E26L27置换,并对突变体的生物活性进行了评价。结果显示:突变后PTH(1 34)-(RKK-QEL)和突变前PTH(1 34)多肽主链叠合后均方根偏差RMSD值为2.509 3,说明两者主链结构构象差异不大;PTH(1 34)-(RKK-QEL)与受体蛋白PTH1R的相互作用能为599.253 kcal.mol 1,较天然PTH(1 34)的554.083 kcal.mol 1增强7.5%;氢键数目由32对增加至38对;PTH(1 34)-(RKK-QEL)能显著刺激UAMS-32P细胞RANKL基因的表达(P<0.01),并抑制OPG基因的表达(P<0.01);PTH(1 34)-(RKK-QEL)作用于UAMS-32P和小鼠原代股骨骨髓细胞共培养体系时,能显著刺激破骨细胞的形成(P<0.01),并且活性高于PTH(1 34)标准品。     

甲状旁腺素和甲状旁腺素相关肽在皮肤病中的研究进展

甲状旁腺素（ PTH）和甲状旁腺素相关肽（ PTHrP）是一类多肽类激素,它们具有相似的基因结构、相同的膜受体,在人体钙、磷代谢过程中起着重要的调节作用。 PTH和PTHrP及其受体除表达于肿瘤组织外,在皮肤、毛囊等正常组织也有表达。它们对表皮增殖分化、毛发生长的生理作用等方面,有望成为银屑病等常见皮肤病的治疗新靶点。     

注射用重组人甲状旁腺素(1-34)在健康人体的药代动力学

目的研究注射用重组人甲状旁腺素(1-34)[rhPTH(1-34)](激素)在中国健康人体内的药代动力学特征。方法30名健康受试者随机分为10,20,40μg3个剂量组,每组10人,用免疫放射测定法(IRMA)测定人血浆中甲状旁腺激素(PTH)浓度。结果药代动力学参数:tmax分别为(32.5±9.5),(24.0±9.7)和(35.0±13.5)min;Cmax分别为(0.14±0.04),(0.20±0.05)和(0.30±0.04)ng.mL-1;t1/2分别为(47.7±12.1),(50.1±16.4)和(53.6±14.4)min;AUC(0-240)分别为(9.79±1.46),(15.42±1.66)和(32.72±3.16)ng.min.mL-1。结论单次皮下注射重组人甲状旁腺素(1-34)在低、中、高3个剂量内,Cmax和AUC呈线性增长,与剂量呈正相关;体内代谢呈线性代谢特征,与国外报道基本一致。     

人甲状旁腺素(1-34)的合成与聚乙二醇化修饰

目的合成人甲状旁腺素(1 34) [hPTH(1-34) ]并进行聚乙二醇化修饰。方法应用固相多肽合成方法合成并经高效液相色谱纯化得hPTH(1-34) ,Cys-hPTH(1- 34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 。Cys hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 在水溶液(pH 7～8)中分别与平均相对分子质量为5 0 0 0的单甲氧基马来酰亚胺基聚乙二醇(mPEG50 0 0 MAL)反应,经高效液相色谱纯化得Cys(mPEG50 0 0 MAL)- hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys(mPEG50 0 0- MAL) -NH2 。结果hPTH(1-34) ,Cys(mPEG50 0 0 MAL) hPTH(1 34)和hPTH(1 34) Cys(mPEG50 0 0 MAL) NH2 的质谱和氨基酸组成分析结果均与理论值一致。hPTH(1-34) -Cys(mPEG50 0 0-MAL) NH2 保持了较好的体外活性,Cys(mPEG50 0 0- MAL) hPTH(1-34)保持了较好的体内活性。结论采用一种简便的方法成功实现了对hPTH(1-34)的N端或C端的聚乙二醇化修饰     

重组人甲状旁腺激素1-34多次皮下注射给药的人体药动学特征

目的研究健康志愿者多次皮下注射重组人甲状旁腺激素1-34[(rhPTH(1-34)]后体内的药动学特征。方法8名健康志愿者多次皮下注射rhPTH(1-34)后,采用放射免疫法测定血浆中rhPTH(1-34)浓度,评估它的药动学特性。结果rhPTH(1-34)的主要药动学参数如下:d 1,AUC0→t为(17103.3±2243.3)ng.min.L-1,AUC0→∞为(20471.3±2444.6)ng.min.L-1,ρmax为(171.2±34.2)ng.L-1,tmax为(38.1±15.1)min,t12为(55.7±3.9)min;d 7,AUC0→t为(17759.6±3781.5)ng.min.L-1,AUC0→∞为(20698.4±3374.6)ng.min.L-1,ρmax为(184.6±36.8)ng.L-1,tmax为(35.0±16.0)min,t12为(51.6±7.6)min,蓄积系数R为1.02±0.18。结论多次皮下注射rhPTH(1-34)后,与单次给药相比它在人体内的吸收、消除不随连续给药变化,药物在体内没有蓄积作用。rhPTH(1-34)的安全耐受性良好。性别对药动学参数没有影响。     

A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis

The success of solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) amino acids is often limited by deleterious side reactions which occur during TFA peptide-resin cleavage and side-chain deprotection. The majority of these side reactions modify susceptible residues, such as Trp, Tyr, Met, and Cys, with TFA-liberated side-chain protecting groups and linkers. The purpose of this study was to assess the relative effectiveness of various scavengers in suppressing these side reactions. We found that the cleavage mixture 82.5% TFA: 5% phenol: 5% H₂O : 5% thioanisole : 2.5% EDT (Reagent K) was maximally efficient in inhibiting a great variety of side reactions. Synthesis and cleavage of 10 peptides, each containing 20-50 residues, demonstrated the complementarity of Fmoc chemistry with Reagent K for efficient synthesis of complex peptides.