POLD1基因反义RNA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用北大核心CSCD

目的研究DNA聚合酶δ催化亚基基因1(POLD1)反义RNA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用及相应机制。方法将SMMC-7721细胞分为3组:实验组、阴性对照组、空白组。实验组及阴性对照组分别将POLD1基因反义RNA表达质粒及空质粒分别转染至SMMC-7721细胞,未经处理的SMMC-7721细胞为空白组。用聚合酶链反应法检测各组细胞POLD1基因表达情况;用细胞计数-8(CCK-8)法检测细胞增殖情况;用流式细胞术分析细胞凋亡率;用蛋白质印迹(Western blot)法检测p53、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等凋亡相关蛋白表达量。结果实验组、阴性对照组和空白组肝癌细胞POLD1基因相对表达量分别为0.18±0.03,1.03±0.18和1.00±0.00;转染72 h增殖情况(OD_(450)值)分别为0.57±0.06,0.73±0.09和0.77±0.12;凋亡率分别为(23.43±4.12)%,(9.12±1.03)%,(1.24±0.14)%,实验组的上述指标与阴性对照组和空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论POLD1基因反义RNA可显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖,且能诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡。     

牡荆素对人肝细胞癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用及其机制的影响

目的: 研究牡荆素(vitexin)对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用, 并初步探讨其作用机制。方法: 体外培养人肝癌细胞SMMC-7721, 分别采用MTT法和Hoechst33258核染色法检测牡荆素对人肝癌细胞SMMC-7721活力的影响以及观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率和线粒体膜电位(ΔΨm) 变化;蛋白免疫印迹法检测p53、Bcl-2、Bax等相关凋亡蛋白水平的表达情况。结果: 牡荆素培养人肝癌细胞SMMC-7721 48, 72, 96 h后能明显抑制细胞增殖, 呈时间-剂量依赖性(P<0.05), 其IC₅₀分别是150.37, 116.24, 90.19 μmol·L^-1。牡荆素作用于人肝癌细胞SMMC-7721 72 h后, 以浓度依赖性方式增加细胞凋亡率、降低线粒体膜电位(ΔΨm) 以及上调p53、Bax、Caspase-3等相关促凋亡蛋白的表达, 下调Bcl-2抗凋亡蛋白的表达。结论: 牡荆素能抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖诱导凋亡, 呈时间-剂量依赖性, 其作用机制可能通过依赖P53途径下调Bcl-2, 上调Casepase-3、Bax、P53、PARP等基因表达, 进而诱导凋亡有关。     

葛根素对γδT细胞杀伤肝癌SMMC-7721细胞的影响

目的探讨葛根素对人γδT细胞杀伤肝癌SMMC-7721细胞的影响及机制。方法异戊烯焦磷酸法(isopentenylpyrophosphate,IPP)体外扩增人外周血γδT细胞,不同浓度葛根素作用于γδT细胞24,48,72 h,CCK8法检测葛根素对γδT细胞增殖率的影响,FCM检测γδT细胞穿孔素(perforin,PFP)、颗粒酶B(granzyme B,Gra B)及CD107a的表达情况,LDH释放法检测γδT细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤活性,Western blot法检测γδT细胞中P-ERK1/2和Bcl-2的表达情况。结果葛根素作用人γδT细胞48 h后,葛根素1.6~100μmol·L?1浓度组的γδT细胞增殖明显(P<0.05),葛根素12.5~50μmol·L?1浓度组人γδT细胞PFP、Gra B及CD107a表达明显高于对照组(P<0.05),葛根素3.125~50μmol·L?1浓度组人γδT细胞P-ERK1/2和Bcl-2表达显著增高(P<0.05),且葛根素3.125~50μmol·L?1浓度组人γδT细胞对肝癌SMMC-7721细胞杀伤活性较对照组明显增强(P<0.05)。结论葛根素能够促进人γδT细胞增殖,并能够提高γδT细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤活性,其机制可能与上调γδT细胞表面的PFP,Gra B和CD107a的表达及活化P-ERK1/2和Bcl-2的表达有关。     

透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞p53和PUMA蛋白表达的影响

目的观察透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞形态和p53和p53上调凋亡调控因子(PUMA)蛋白表达的影响,探讨透骨草提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制。方法用倒置显微镜观察透骨草提取物对SMMC-7721细胞形态的影响;采用免疫组化方法检测透骨草提取物对SMMC-7721细胞p53和PUMA蛋白表达的影响。结果倒置显微镜观察可见,40.91μg/mL透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞体积减小,形态轮廓不清晰,细胞皱缩变形,细胞脱壁增加。免疫组化检测结果显示,40.91μg/mL透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞p53蛋白和PUMA蛋白表达均明显高于与对照组(P<0.01)。结论透骨草提取物可能通过上调p53和PUMA蛋白表达,诱导SMMC-7721细胞凋亡。     

hTERT反义寡核苷酸增强DDP介导细胞凋亡作用

目的研究端粒酶催化亚基(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对HeLa细胞端粒酶活性的抑制及其对顺铂(DDP)诱导细胞凋亡的影响。方法用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)定量端粒酶重复扩增法(TRAP)检测细胞的端粒酶活性。观察细胞凋亡的形态学变化,流式细胞仪对细胞凋亡进行定量分析。结果ASODN作用后,细胞的端粒酶活性明显降低,且这种作用具有明显的时间和剂量依赖性。0.05、0.1μmol.L-1和0.2μmol.L-1的硫代ASODN治疗后,HeLa细胞的端粒酶活性分别下降了21.8%、52.4%和71.1%。0.2μmol.L-1的硫代ASODN作用HeLa24、48h和72h后,细胞的端粒酶活性分别下降了12.48%、38.27%和71.10%。细胞转染0.2μmol.L-1浓度的ASODN24h后再与1.5、3.0mg.L-1浓度的顺铂联合作用,吖啶橙染色可见典型的凋亡形态,并且凋亡百分率(50.35%、29.67%)分别与RSODN联合顺铂组(19.33%、12.13%)、单用顺铂组(19.67%、11.38%)比较,差异有显著性(P<0.05)。结论hTERT反义寡核苷酸能有效抑制其端粒酶活性,并且促进DDP诱导HeLa细胞凋亡。     

维生素C体外抑制宫颈癌H eLa细胞株生长及其机制的研究

目的探讨维生素C对人宫颈癌HeLa细胞生长和凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法用MTT比色法检测细胞生长抑制作用,流式细胞术测定各组细胞周期分布和凋亡率,以间接免疫荧光法流式细胞术检测相关蛋白的表达,以TRAP-PCR-ELISA法测定端粒酶活性。结果维生素C能以浓度依赖和时间依赖方式阻滞HeLa细胞于G0/G1期,抑制其生长并诱导凋亡。同时HPV18 E6、Bc l-2蛋白表达下调,wtp53、Bax蛋白表达上调,端粒酶活性降低。结论维生素C可抑制HeLa细胞生长,使其细胞周期阻滞于G0/G1期,并诱导其凋亡;其原因在于病毒癌基因E6表达的降低,以及由此而引起的端粒酶活性的降低和细胞内蛋白表达水平的改变,包括HPV18 E6、Bc l-2蛋白表达的下调,wtp53、Bax蛋白表达的上调。     

没食子酸诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡机制的探讨

目的探讨没食子酸(gallic acid,GA)抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖的作用,揭示其促凋亡的相关分子机制。方法体外培养人肝癌细胞SMMC-7721,MTT法观察细胞在GA作用24、48、72 h后的增殖情况;用倒置显微镜观察细胞形态学的变化;透视电镜观察细胞内部结构变化;Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡;采用RT-PCR技术研究p53 mRNA的变化;应用Western blot法检测p53蛋白水平的表达。探讨GA对人肝癌细胞SMMC-7721的诱导凋亡作用及机制。结果剂量为6.25⁵0μmol·L-1GA作用SMMC-7721细胞48 h有明显的增殖抑制活性,引起核固缩、凝聚、碎裂,诱导细胞凋亡,并呈剂量依赖性;RT-PCR和Western blot结果显示,GA能升高p53 mRNA水平和p53蛋白表达。结论 GA可抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖,诱导凋亡,可能与其上调肿瘤相关抑癌基因p53有关。     

hTERT反义寡核苷酸对肝癌SMMC-7721细胞株细胞增殖和端粒酶活性的影响

目的研究hTERT基因反义寡核苷酸（ASPSODN）对SMMC-7721细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响。方法不同浓度的ASPSODN转染到SMMC-7721细胞株24h和48h后分别采用MTT法、TRAP-ELISA法检测SMMC-7721细胞的增殖活性及端粒酶活性。结果各浓度组的ASPSODN均能降低端粒酶活性,作用24h时,不同浓度均明显受抑,其中0.8μmol/L ASPSODN较0.2μmol/L和0.4μmol/L组抑制作用更明显（P〈0.05）,但再增大浓度抑制作用并不随着增加。作用48h后,抑制作用减弱,低浓度组（0.2、0.4μmol/L）端粒酶活性恢复到正常水平,而高浓度组（0.8、1.0、1.2μmol/L）抑制作用依然明显,端粒酶活性低于60%。MTT法检测显示,不同浓度ASPSODN组对SMMC-7721细胞的生长均有抑制作用,随着浓度的增加,抑制作用明显,但随着时间的延长,抑制作用增加不明显。结论 ASPSODN靶向hTERT能特异性抑制SMMC-7721细胞增殖,明显下调端粒酶活性,hTERT可能成为肝癌治疗的一个靶点。     

肝动脉化疗栓塞术后细胞凋亡与端粒酶活性的研究

目的　测定原发性肝癌病人肝动脉化疗栓塞后细胞凋亡、端粒酶活性、p53蛋白、sIL 2R和T淋巴细胞亚群表达的变化 ,进而比较不同药物联合TACE的治疗效果。方法　 60例原发性肝癌病人 ,按治疗药物不同分 4组 ,用TUNEL法、TRAP PCR ELISA法及免疫组化法 ,分别测定细胞凋亡、端粒酶活性、T淋巴细胞亚群及sIL 2R的表达。结果　 60例HCC细胞凋亡、端粒酶和p53蛋白阳性率均明显高于对照组 (P <0 0 1) ,p53蛋白阳性率与AI呈负相关 (r =-0 42 3 ,P <0 0 5) ;治疗后sIL 2R的表达较治疗前下降 (P <0 0 5) ,CD 3 、CD 4和CD 3 /CD 4比值较治疗前上升 ,并与疗效有关 ;TACE PEI组和TACE LAK组疗效均高于常规组 (P <0 0 5)。结论　TACE PEI组和TACE LAK组治疗原发性肝癌效果较好     

siRNA-DAD1联合人参皂苷Rh 2对肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨基因沉默DAD1 联合人参皂苷Rh2 对肝癌细胞增殖和凋亡的作用机制。方法　化学合成siRNADAD1,然后转染肝癌SMMC-7721 细胞,分别采用Q-PCR 和Western blot 检测DAD1 的mRNA 及蛋白表达水平变化,CCK-8 法检测肝癌SMMC-7721 细胞增殖能力的改变,DNA Ladder 法和流式细胞术检测肝癌SMMC-7721 细胞凋亡的变化。结果　siRNA-DAD1 可下调肝癌SMMC-7721 细胞中DAD1 的mRNA 及蛋白表达水平;siRNA-DAD1 与人参皂苷Rh2 均具有抑制SMMC-7721 细胞增殖的能力,并促使其发生凋亡,二者联合作用效果更好（P<0.05）。结论　siRNADAD1可下调肝癌SMMC-7721 细胞中DAD1 的mRNA 和蛋白表达水平,与人参皂苷Rh2 协同抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖并促进其凋亡。     

Mucin-4在百里醌抑制肝癌生长中的作用

目的 探讨百里醌对体内外肝癌生长的影响,并对其机制进行初步探讨.方法 不同浓度百里醌作用人肝癌细胞株SMMC-7721后,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测其对细胞生长的抑制作用;Hoechst染色后荧光显微镜下观察细胞形态学变化;RT-PCR检测Mucin-4 mRNA在SMMC-7721细胞中的表达;Western blot-ting检测肝癌细胞中Mucin-4蛋白表达;建立裸鼠肝癌皮下移植模型,完全随机法分为对照组和低（10 μmol/L）、中（20 μmol/L）、高剂量（40 μmol/L）百里醌组,观察不同剂量百里醌对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长的影响;免疫组织化学法检测肿瘤组织中Mucin-4的阳性表达.结果 不同浓度（10、20、40 μmol/L）百里醌作用人肝癌SMMC-7721 24 h后,细胞存活率分别为（80.14±9.84）％、（71.68±6.51）％和（64.58±5.24）％;百里醌作用后,SMMC-7721细胞出现典型凋亡形态学改变;百里醌干预后SMMC-7721细胞中Mucin-4蛋白和mRNA的表达均明显下调,呈浓度依赖性;实验结束后,对照组和低、中、高剂量百里醌组肿瘤体积分别为（1056.3±236.3）、（672.3±178.8）、（529.4±165.7）、（473.1±141.5） mm2,各百里醌组肿瘤体积明显低于对照组（P＜0.05）,低、中、高剂量百里醌组抑瘤率分别为36.5％ 、49.9％和30.3％;百里醌可明显降低肿瘤组织中Mucin-4的阳性表达.结论 百里醌可显著抑制体内外肝癌生长,该作用可能通过抑制Mucin-4的表达而实现.     

聚乙二醇化多聚β肽抗肝癌转移的体内外实验研究

目的：观察多聚β肽及其聚乙二醇（PEG）修饰物对肝癌细胞株侵袭黏附能力和对裸鼠移植人肝癌早期切除术后转移复发的影响。方法：以MTT法测量多聚β肽和其PEG修饰物对肝癌细胞与纤连蛋白（FN）黏附的影响。以细胞侵袭实验观察多聚β肽及其PEG修饰物对肝癌细胞侵袭能力的影响。以LCI-D20裸鼠人肝癌转移模型为材料，观察多聚β肽及其PEG修饰物对早期肝癌切除术后转移复发的影响。结果：β2、β2-PEG、β3和β3-PEG对SMMC-7721细胞与FN黏附抑制率分别为31．3％、39．2％、45．7％和57．1％，侵袭抑制率分别为33．6％、35．9％、38．3％和41．2％；对HCCLM6细胞与FN的黏附抑制率分别为48．7％、60．9％、63．4％和79．3％，侵袭抑制率分别为36．8％、46．6％、45．6％和50．8％。多聚β肽及其PEG修饰物组切缘复发肿瘤重量和肺转移灶个数显著低于对照组（P％0．05）。结论：多聚β肽及其PEG修饰物能抑制肿瘤细胞的黏附和侵袭能力，亦能防治裸鼠移植人肝癌早期切除术后的转移和复发。     

三氧化二砷对人肝癌细胞生长及其尿型纤溶酶受体表达的体外研究

目的:体外研究三氧化二砷(As2O3)对人肝癌细胞株SMMC-7721生长及其表达尿型纤溶酶受体(uPAR)的影响。方法:SMMC-7721在不同浓度的As2O3作用不同时间后,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析As2O3对uPARmRNA表达的影响,并设立不加As2O3的对照组。结果:As2O3对SMMC-7721细胞的生长呈明显的抑制作用,且呈时间、浓度依赖性;与对照组比较,As2O3实验组G0/G1期细胞比例明显降低,G2/M期细胞比例提高(P<0.05),uPARmRNA表达量明显减少(P<0.01)。结论:As2O3能有效抑制肝癌细胞株SMMC-7721的生长,下调uPARmRNA的表达可能是其作用机制之一。     

维A酸注射液对人肝癌细胞SMMC-7721及其裸小鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究维A酸注射液对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制作用及其对裸鼠移植瘤生长的影响。方法:采用细胞计数试剂盒检测不同浓度维A酸注射液对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用,计算半数抑菌浓度(IC50)。建立裸鼠SMMC-7721移植瘤模型,分为阴性对照组(n=12)、阳性对照(顺铂1mg.kg-1)组和维A酸低、中、高剂量(7.5、15、30mg.kg-1)组,后4组各6只。腹腔给予相应药物,每周连续给药5d后停药2d,共给药4周,每周检测各组裸小鼠体重、肿瘤体积(TV)、相对肿瘤体积(RTV)、相对肿瘤增殖率(T/C),及末次给药2d后移植瘤组织中凋亡细胞阳性率和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达。结果:维A酸注射液对SMMC-7721细胞的IC50为(15.14±0.46)μg.mL-1。小鼠给药19d(治疗疗效最佳时间)时,与阴性对照组比较,其余各组TV、RTV均明显下降(P<0.05或P<0.01),体重无明显变化,T/C均小于60%;末次给药2d后,与阴性对照组比较,维A酸3个剂量组凋亡细胞阳性率和Caspase-3表达明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:维A酸注射液能抑制SMMC-7721细胞的增殖及其裸小鼠移植瘤的生长,其机制可能与促进细胞凋亡和Caspase-3表达有关。     

糙苏素的抗肿瘤作用及机制研究

目的:研究糙苏素的抗肿瘤作用及其对端粒酶活性和细胞周期的影响。方法:采用血清药理学与体内、外抑瘤实验相结合的方法,MTT法检测糙苏素含药血清对体外培养的人白血病K562细胞增殖的抑制作用,聚合酶链反应-酶联免疫吸附法检测K562细胞在糙苏素作用后端粒酶活性的变化,流式细胞仪分析细胞周期的改变;体内实验采用小鼠肝癌H22细胞株接种小鼠,连续给药14d,计算抑瘤率。结果:糙苏素含药血清在10%～50%剂量范围内对K562细胞有抑制作用,且呈剂量依赖关系(P<0.05);糙苏素作用后端粒酶活性出现抑制,且各给药组随糙苏素浓度增加抑制作用显著增强(P<0.01),同一浓度随作用时间延长,抑制作用逐渐增强(P<0.05);K562细胞的DNA合成后期/分裂期(G2/M)细胞含量显著增高(P<0.01);糙苏素(2.5、5、10mg·kg-1)灌胃能显著抑制小鼠移植性肝癌H22细胞的生长。结论:糙苏素具有抗肿瘤作用,其作用是通过抑制肿瘤细胞的端粒酶活性而实现的。     

加热对肿瘤细胞热休克蛋白70产生的影响及意义

目的探讨加热对肿瘤细胞热休克蛋白70产生的影响,为热疗治疗肿瘤提供理论依据。方法对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721进行加热,42℃,2h,用超声细胞破碎仪破碎已经加热的SMMC-7721细胞,高速离心,用SDS-PAGE和Western blot方法对上清中HSP70的表达进行鉴定。结果加热42℃,2h的肝癌细胞热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）有较高表达。结论经加热42℃,2h的肝癌细胞热休克蛋白70（HSP70）有较高表达,为热疗治疗肿瘤提供了实验数据。     

透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响

目的观察透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响,进一步探讨透骨草提取物对SMMC-7721细胞增殖抑制的分子机制。方法MTr法检测透骨草提取物对SMMC-7721细胞增殖的影响,免疫组化方法检测SMMC-7721细胞β-catenin和cyclinD1蛋白的表达。结果6．25—100μg／ml透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞增殖抑制率与对照组相比显著增加（P〈0．05）,而且随透骨草浓度的增加,抑制率逐渐增加。透骨草提取物对SMMC-7721细胞的半数抑制浓度（IC50）为40．91ug/ml。40．91μg／m1透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞β—catenin和cyclinD1的表达明显低于对照组（P〈0．05）。结论透骨草提取物对SMMC-7721细胞的增殖有抑制作用,其机制可能与下调β-catenin和cyclinD1的蛋白表达有关。     

端粒酶与Ki-67及p53在大肠癌和大肠腺瘤病变中的关系

目的：探讨端粒酶与Ki-67、p53在大肠癌和腺瘤的表达及发生、发展机理。方法：用组织芯片原位杂交的方法在分子学水平对细胞的端粒酶进行检测,同时用免疫组织化学法对Ki-67,p53进行检测。结果：72例大肠癌端粒酶表达的阳性率为77．78％,Ki-67阳性率88．89％,p53阳性率63．89％;36例大肠腺瘤端粒酶表达阳性率8．3％,p53阳性率22．22％,Ki-67阳性率13．89％。端粒酶和Ki－67、p53的阳性表达在大肠癌和大肠腺瘤之间的差异有显著性（P〈0．05）。结论：端粒酶和K-i67、P53在大肠细胞癌变过程中有一定的协同作用。