乳腺癌组织miR-20a的表达及其对乳腺癌细胞自噬的影响

目的 探究乳腺癌患者肿瘤组织中miR-20a的表达情况及其对乳腺癌细胞自噬功能的作用。 方法 收集芜湖市第一人民医院2016年1月至2017年12月间收治的接受手术治疗的乳腺癌患者56例,逆转录实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肿瘤组织与癌旁组织miR-20a与自噬相关基因Beclin1、LC3、ATG5及ATG7 mRNA的表达水平。脂质体法转染pcDNA3/pri-miR-20a质粒至MCF7细胞,免疫蛋白印记实验检测Beclin 1与饥饿条件下LC3Ⅱ表达水平,免疫荧光实验检测自噬斑点。 结果 肿瘤组织miR-20a的平均表达水平为211.35±67.43,癌旁组织miR-20a的平均表达水平为126.72±24.37,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,肿瘤组织较癌旁组织Beclin1 mRNA表达量降低(P<0.05),ATG5、ATG7与ATG12 mRNA的表达量差异无统计学意义 (P>0.05)。过表达miR-20a后MCF7细胞Beclin1蛋白表达量降低,饥饿刺激下LC3Ⅱ表达水平降低且自噬斑点减少。 结论 乳腺癌组织中miR-20a呈高表达,并且降低自噬调节蛋白Beclin1的表达以抑制自噬活化。     

大鼠血睾屏障形成初期细丝蛋白A对肌动蛋白丝排布的影响

目的根据肌动蛋白丝(F-actin)在血睾屏障(BTB)形成与变化过程中发挥的作用,初步探讨细丝蛋白A(FLNA)在大鼠血睾屏障形成初期对F-actin排布的影响。方法 Western印迹检测FLNA在大鼠睾丸、支持细胞及精子中的表达;免疫荧光染色观察FLNA与F-actin在20d龄大鼠生精上皮中的共定位;体外无血清体系分离培养大鼠睾丸支持细胞,待细胞连接形成后通过siRNA干扰沉默FLNA的表达,鬼笔环肽染色观察F-actin的分布定位;睾丸内siRNA注射,观察FLNA对血睾屏障形成时F-actin分布的影响。结果 FLNA在20d龄大鼠主要由支持细胞表达,体外siRNA沉默FLNA的效率可达70%以上,在体外支持细胞连接形成及体内屏障形成过程中,FLNA沉默组的F-actin与对照组相比排列紊乱、无序。结论 FLNA参与调节大鼠血睾屏障形成初期FLNA的排布。     

多胺代谢与自噬在增龄大鼠心脏中的变化及外源性精脒对衰老心脏自噬的影响

目的探讨增龄大鼠心脏多胺代谢与自噬的变化规律,以及精脒对衰老心脏自噬的影响。方法 Westen blot法检测3、6、12、24月龄大鼠心肌多胺合成与分解代谢限速酶ODC与SSAT表达,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ与p62的表达;检测3、24月龄及给予精脒6周的24月龄大鼠心肌ATG5、ATG7、p16表达。观察心肌自噬小体形成、计算细胞横截面积及细胞凋亡率、检测活性氧(ROS)产生。结果随年龄增加,心肌ODC与LC3-Ⅱ/Ⅰ表达降低,SSAT与p62表达增加。24月龄大鼠心肌p16表达增加,细胞横截面积增大,细胞凋亡及ROS产生增多,自噬小体减少,p62表达增加,LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5和ATG7表达降低。精脒干预后能明显抑制衰老诱导的以上指标的改变。结论随着年龄增加,大鼠心肌多胺合成代谢下调,分解代谢上调,细胞自噬能力下降。外源性精脒可能通过诱导心肌细胞自噬延缓大鼠心脏老化。     

SAHA-CTSV轴通过诱导过度自噬抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长

目的研究SAHA-CTSV轴通过诱导过度自噬抑制乳腺癌MCF-7细胞生长的作用和机制。方法以人乳腺癌MCF-7细胞为研究目标,Muse细胞分析仪检测SAHA对细胞活力的作用;Real-time PCR和Western blot检测SAHA对CTSV的mRNA及蛋白表达的影响,同时检测利用siRNA干扰技术敲除CTSV后的细胞CTSV表达水平;细胞免疫荧光法检测SAHA对LC3II分子的作用;Real-time PCR和Western blot检测SAHA诱导自噬过程中相关ATG分子和LC3的mRNA和蛋白的变化;Bafilomycin A1抑制自噬,随后利用Western blot和Muse细胞分析仪分别检测p62蛋白水平和SAHA作用后的细胞活力。结果SAHA可以抑制MCF-7细胞的增殖,并促进CTSV的表达。CTSV-siRNA转染细胞后,CTSV的mRNA和蛋白水平均显著性降低。SAHA增加了LC3免疫荧光点的分布,与CTSV-siRNA共同作用可恢复由CTSV-siRNA敲减引起的细胞自噬减弱。SAHA在增强ATG4C和Beclin1表达的同时,LC3B也随之升高而mTOR则下降。抑制CTSV表达后也同时逆转了SAHA的效应。Bafilomycin A1阻断自噬后,被SAHA抑制的p62蛋白的表达和细胞活力显著增强。结论SAHA-CTSV轴通过诱导过度自噬抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长。     

自噬促进IL-1β诱导的大鼠INS-1胰岛β细胞凋亡

目的观察自噬在IL-1β促进INS-1胰岛β细胞凋亡中的作用。方法体外培养大鼠INS-1胰岛β细胞株,给予不同浓度IL-1β干预,用CCK-8法检测在不同作用时间点INS-1细胞的存活率;用Western blot技术检测不同IL-1β浓度下自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的表达水平;Western blot法和流式细胞术检测INS-1细胞的凋亡水平。结果 IL-1β可以降低INS-1细胞的存活率,且呈浓度及时间依赖性(P<0.05,P<0.01)。与对照组相比,随着IL-1β浓度的增高,INS-1细胞凋亡水平逐渐升高(P<0.05),且细胞自噬水平也随着IL-1β浓度的增高而逐渐增高(自噬相关蛋白LC3、Beclin1表达上升,P62降低,P<0.05)。采用自噬激动剂雷帕霉素预处理细胞上调自噬可进一步增加IL-1β诱导的细胞凋亡,而用自噬抑制剂3-MA预处理抑制细胞自噬后则可逆转IL-1β诱导的INS-1胰岛细胞凋亡。结论 IL-1β通过诱导自噬增加促进INS-1胰岛β细胞凋亡。     

内皮-单核细胞激活多肽对人U118胶质瘤细胞自噬的影响及机制

目的研究内皮-单核细胞激活多肽(EMAP-Ⅱ)对人U118脑胶质瘤细胞自噬的影响及可能机制。方法 EMAP-Ⅱ处理人U118胶质瘤细胞后,采用MTT检测细胞活力;用免疫荧光法检测自噬标记物微管相关蛋白轻链-3(LC3)在U118细胞的分布;Western blot方法检测LC3-Ⅱ、自噬降解底物p62/SQSTM1和自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平。结果与EMAP-Ⅱ0 h组相比,0.05 nmol.L-1剂量以上的EMAP-Ⅱ可明显抑制人U118胶质瘤细胞的活力,降低线粒体膜电位(MMP),在EMAP-Ⅱ作用0.5 h时效果最明显;自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)能够阻断EMAP-Ⅱ的作用,使细胞活力和线粒体膜电位基本恢复;EMAP-Ⅱ作用0.5 h后自噬标记物LC3在胞质内呈点状分布,荧光表达明显增强,并且LC3-Ⅱ的蛋白表达水平明显上调;同时伴有自噬降解底物p62/SQSTM1的表达下降;此外,自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平明显上调。结论 EMAP-Ⅱ能明显抑制人U118胶质瘤细胞活力,诱导U118细胞发生自噬,其机制可能与自噬相关蛋白Beclin1上调有关。     

模拟海拔8000m高原缺氧环境对大鼠脑组织线粒体自噬的影响

目的：研究大型低压氧舱模拟海拔8000 m 高原缺氧环境对大鼠线粒体自噬的影响。方法取30只Wistar 大鼠,随机分为正常、缺氧6 h、12 h、24 h 和48 h 组,每组6只,在大型低压氧舱中模拟海拔8000 m 高原缺氧环境,采集实验大鼠的脑组织进行电镜观察并对线粒体自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）、Beclin1以及凋亡相关蛋白细胞色素 C（CytC）、Caspase3、Bcl-2相关 X 蛋白（Bax）进行测定。结果电镜结果显示,不同时间缺氧组与正常组相比较,大鼠脑组织空泡增多,细胞间隙增大,细胞膜部分破碎,细胞受损,并且不同缺氧时间自噬发生程度较正常组均增多,缺氧24 h 组自噬程度最强,自噬体数量最多。各缺氧组凋亡相关蛋白 CytC、Caspase3和 Bax 表达水平随着缺氧时间的延长均上调,缺氧24 h 和48 h 组显著高于正常组（ P ﹤0.01）。自噬相关蛋白 LC3和 Beclin1表达随着缺氧时间增加呈现从升高到下降的趋势,其中 LC3在缺氧24 h 组表达程度最高（P ﹤0.05）,Beclin1蛋白在缺氧6 h 组表达升高,缺氧12 h 组表达最高（P ﹤0.01）。结论模拟海拔8000 m 缺氧环境会对大鼠造成损伤,促进凋亡相关蛋白的表达,同时促进了大鼠脑组织线粒体自噬的发生。     

青蒿琥酯激活ATF4/CHOP通路对人胃癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响

摘要：目的:探究青蒿琥酯（ART）对人胃癌细胞增殖、凋亡和自噬以及激活转导因子4/C/EBP同源蛋白（ATF4/CHOP）通路的影响。方法:细胞计数试剂盒8（CCK-8）法和乳酸脱氢酶（LDH）法筛选ART干预人胃癌细胞系MGC803的最佳条件。原位末端标记（TUNEL）染色法观察细胞凋亡,并对半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3和Caspase-9活性进行测定;免疫荧光染色法观察细胞自噬蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）表达;Western Blot分析验证自噬（Beclin和ATG5）和ATF4/CHOP通路相关蛋白表达。结果:ART以浓度依赖性方式降低MGC803细胞活力（P＜0.05）。ART治疗后促进MGC803细胞凋亡、Caspase-3和Caspase-9活性,增强LC3、Beclin和ATG5表达,上调ATF4和CHOP表达（P＜0.05）。自噬抑制剂3-MA或沉默ATF4可部分逆转ART对胃癌细胞的影响（P＜0.05）。结论:ART可能通过激活ATF4/CHOP通路在胃癌细胞中发挥抗增殖和促凋亡、自噬作用。     

褪黑素对自然衰老大鼠肾脏保护作用的研究

目的:探讨mTOR信号介导的自噬在褪黑素(melatonin,Mel)减轻自然衰老SD大鼠肾脏损害的作用及机制。方法:将40只8周龄SD大鼠随机分为4组,空白对照组(A组)、单纯褪黑素处理组(褪黑素10 mg·kg^-1·d^-1,B组)、老年模型组(C组)和褪黑素干预老年模型组(褪黑素10 mg·kg^-1·d^-1,D组)。A组与B组大鼠用普通饲料饲养4周后取材,C组与D组大鼠以普通饲料饲养18个月后取材,测定血清肌酐(Scr)、尿素氮(UN)以检测肾功能,HE染色观察肾脏组织形态变化,TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况,Western-blot检测肾脏组织自噬相关蛋白LC3B、Beclin1、p62和磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达,免疫荧光染色法检测肾脏组织LC3B蛋白的表达。结果:与A组相比,B组各项指标均无明显变化;C组肾脏组织肾小球萎缩,Scr和UN水平显著升高(P<0.05),TUNEL阳性细胞数量明显增加(P<0.05),LC3B和Beclin1表达显著升高(P<0.05),而p62和p-mTOR的表达降低(P<0.05),免疫荧光染色法检测结果显示肾脏组织中LC3B蛋白表达增加(P<0.05);D组大鼠的肾小球形态明显改善,Scr和UN血清水平降低(P<0.05),TUNEL阳性细胞数减少(P<0.05),LC3B和Beclin1的表达减少(P<0.05),免疫荧光染色法检测到LC3B的表达降低(P<0.05)。结论:褪黑素可通过调节mTOR信号介导的自噬减轻老年SD大鼠肾脏损伤程度。     

缬沙坦对颈动脉粥样硬化大鼠AT1R/PI3K/Akt/mTOR通路及血管内皮细胞自噬的影响

目的探讨缬沙坦对颈动脉粥样硬化大鼠血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路及血管内皮细胞自噬的影响。方法采用高脂饲料饲喂结合颈动脉球囊损伤法制备颈动脉粥样硬化大鼠模型,随机分为模型组(生理盐水),缬沙坦低、中、高(10、20、30 mg/kg)剂量组和阳性对照组(阿托伐他汀,2.5 mg/kg),另取假手术大鼠作为对照组(生理盐水),每组15只,均每天ig给药1次,连续4周,给药体积10 mL/kg。末次给药结束24 h后,全自动生化分析仪检测各组大鼠血脂水平,包括总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C);酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组大鼠颈动脉血清中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠颈动脉内皮组织病理学变化;单丹磺酰尸胺(MDC)染色法检测各组大鼠颈动脉内皮细胞自噬率;蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测各组大鼠自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin 1和通路蛋白AT1R表达水平及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平。结果与对照组相比,模型组大鼠颈动脉组织内皮细胞排列紊乱,内皮破损,大量炎性因子浸润,TC、TG、LDL-C、IL-1β、TNF-α、IL-6水平及AT1R蛋白表达和PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平显著升高(P0.05),HDL-C水平、细胞自噬率、LC3-Ⅱ和Beclin 1蛋白表达水平显著降低(P0.05);与模型组相比,缬沙坦低、中、高剂量组大鼠颈动脉组织中内膜逐渐平滑,炎性因子浸润依次减少,TC、TG、LDL-C、IL-1β、TNF-α、IL-6水平及AT1R蛋白表达和PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平依次降低(P0.05),HDL水平、细胞自噬率、LC3-Ⅱ和Beclin 1蛋白表达水平显著升高(P0.05);缬沙坦高剂量组与阳性对照组大鼠各项指标差异无统计学意义。结论缬沙坦可能通过下调AT1R/PI3K/AKT/mTOR信号通路,提高LC3-Ⅱ和Beclin 1自噬相关蛋白表达水平,促进颈动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞自噬,减轻炎症反应。     

BHC induced testicular impairments in rats.

Benzene hexachloride (BHC) was fed to mature male rats weighing 160 g at dosages of 3 and 6 mg/kg body weight over a period of 180 days. Significant decrease in testicular weight and degeneration of seminiferous tubules with deformed spermatogenic cells were noted at a dose of 6 mg/kg BHC. Marked increase in BHC residue in testis revealed that the drug was able to cross blood-testis barrier.     

Aluminum maltolate induces primary rat astrocyte apoptosis via overactivation of the class III PI3K/Beclin 1-dependent autophagy signal

Aluminum-induced neuronal cell apoptosis has been implicated in various neurodegenerative disorders. However, whether autophagy, a vital lysosomal degradation pathway, is involved in this pathogenesis still remains unknown. Our present findings demonstrated that aluminum significantly increased rat astrocyte apoptosis and autophagy levels in a dose-dependent manner. Examination of the associated mechanisms revealed that aluminum at low levels (400μM) did not increase apoptosis protein expressions (cleaved caspase-3 and cleaved PARP), but markedly up-regulated autophagy-related protein Beclin 1 expression. This indicates that the autophagy process occurs earlier than neuronal apoptosis. Moreover, aluminum at high levels (1600μM) significantly induced autophagy-related protein (Beclin 1 and LC3II) and apoptosis-related protein expressions, showing that both autophagy and apoptosis processes are activated under high levels of aluminum exposure. We used 3-methyladenine, an inhibitor of class III phosphatidylinositol-3 kinase, to treat astrocytes and found that the apoptosis rate in the 3-MA/aluminum co-treated group was markedly down-regulated compared with aluminum alone-treated astrocytes. The apoptosis protein and autophagy-related protein expressions were also decreased. These observations showed that the mild autophagy process may precede apoptosis in low dose aluminum-insulted astrocytes, and high dose aluminum-induced serious autophagy may result in cell apoptosis via the Beclin 1-dependent autophagy signal pathway.     

黄芪甲苷在高糖诱导的内皮细胞损伤中的作用研究

目的探讨黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-IV)对高糖诱导的内皮细胞损伤的保护作用及机制。方法体外培养人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),使用高浓度葡萄糖(30 mmol/L)诱导细胞损伤,采用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测炎症因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白介素(interleukin,IL)-6和IL-1β的表达。使用不同浓度黄芪甲苷(10、20、50及100 μmol/L)处理高糖损伤的HUVECs,RT-PCR检测炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平。黄芪甲苷干预后,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测TNF-α、IL-6和IL-1β含量,蛋白质印迹法(western blot,WB)检测自噬相关蛋白LC3及Beclin1的表达。进一步将实验分为高糖组、黄芪甲苷组及3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组,RT-PCR检测TNF-α、IL-6和IL-1β的信使RNA(messenger RNA,mRNA)表达水平、WB法检测自噬相关蛋白LC3和Beclin1表达。结果高糖可显著诱导炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达,50 μmol/L黄芪甲苷为最佳抑制炎症反应的浓度。黄芪甲苷组自噬相关蛋白LC3及Beclin1的蛋白水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。与黄芪甲苷组相比,3-MA组自噬相关蛋白LC3和Beclin1的蛋白水平显著降低,TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论黄芪甲苷可保护内皮细胞免于炎症损伤,其作用机制可能与细胞自噬有关。     

大黄蛰虫丸对AOM/DSS诱导结肠炎相关 结直肠癌小鼠的抑制作用

目的:研究大黄蛰虫丸(DZP)对结肠炎相关结直肠癌(CAC)的影响及其可能机制。方法:以C57BL/6小鼠为研究对象,随机分为对照组、模型组,DZP低(2 g·kg^-1)、高剂量组(4 g·kg^-1)。除对照组外,其余各组采用AOM/DSS诱导小鼠CAC模型,并于造模中各组给予相应的药物灌胃干预。实验结束,比较各组小鼠死亡率,并以ELISA检测小鼠血清IL-1β和IL-18水平;苏木素-伊红(HE)染色观察结肠组织损伤情况;免疫荧光染色分析小鼠结肠Occludin和ZO-1的表达;免疫组化染色分析小鼠结肠ATG5、IL-1β和IL-18的表达水平;蛋白印迹检测小鼠结肠中LC3BⅠ/Ⅱ、SQSTM1及ATG5的蛋白表达水平。结果:经8周灌胃给药,对照组、模型组,DZP低、高剂量组的死亡率分别为0%、40.00%、20.00%、6.67%。与模型组相比,DZP能显著降低血清IL-1β和IL-18水平,提高小鼠肠道组织中Occludin和ZO-1的表达水平。同时,DZP能显著降低模型小鼠结肠组织中IL-1β、IL-18及SQSTM1的表达水平,提高模型小鼠肠道组织中的LC3BⅠ/Ⅱ和ATG5的蛋白表达水平。结论:DZP能显著降低CAC模型小鼠的炎症和死亡率;其作用机制可能与促进CAC模型小鼠肠道自噬改善肠道紧密连接相关。     

微小RNA-375调控自噬抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖和转移

目的 探讨微小 RNA-375（miR-375）通过调控自噬相关蛋白（Atg）14 介导的自噬对肝癌细胞（SMMC-7721）增殖和转移能力的影响。方法 将SMMC-7721细胞分别用miR-375模拟物、抑制物以及Atg14的干扰RNA处理,并建立缺氧1 h复氧6 h的模型,分为miR-375 NC组、miR-375 mimics组、miR-375 inhibitor组以及siRNA NC组、Atg14 siRNA 组、miR-375+Atg14 siRNA 组。TargetScan 预测 miR-375 与 Atg14 基因相关性。荧光实时定量 PCR（qRT-PCR）检测miR-375 NC组、miR-375 mimics组、miR-375 inhibitor组miR-375、Atg14 mRNA相对表达量。免疫细胞化学染色检测3组细胞内N-钙黏素（N-Cadherin）和β-连环蛋白（β-catenin）表达分布情况。绿色荧光蛋白-红 色荧光蛋白-轻链（mGFP-RFP-LC3）自噬双标腺病毒转染3组细胞,荧光显微镜下观察自噬体形成情况。平板克隆检测肝癌细胞增殖情况。Western blot 检测Atg14、泛素结合蛋白（P62）、轻链3Ⅰ（LC3Ⅰ）、轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、酵母Atg6同源物（Beclin1）、N-Cadherin、β-catenin和波形蛋白（Vimentin）表达情况。结果 miR-375与Atg14基因相关性较高,qRT-PCR显示过表达miR-375能抑制Atg14 mRNA表达;反之能促进Atg14 mRNA表达。过表达miR-375能抑制肝癌细胞内N-Cadherin表达、提高β-catenin表达水平,抑制肝癌细胞增殖能力（P＜0.01）;而抑制miR-375表达能促进N-Cadherin表达、降低β-catenin表达水平,提高肝癌细胞增殖能力（P＜0.01）。过表达miR-375能抑制Atg14、LC3Ⅱ、Beclin1表达,促进P62表达（P＜0.01）;反之能促进Atg14、LC3Ⅱ、Beclin1表达,抑制P62表达（P＜0.01）。荧 光显微镜下观察到过表达 miR-375 可抑制自噬体形成,而抑制 miR-375 表达能促进自噬体形成（P＜0.01）。干扰Atg14表达后可增强miR-375对肝癌细胞增殖、转移能力的抑制作用（P＜0.01）。结论 激活miR-375能抑制肝癌细胞增殖和转移,而抑制miR-375能促进肝癌细胞增殖和转移,其机制可能与miR-375通过靶向调控Atg14抑制自噬,从而抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖和转移有关。     

右美托咪定通过lncRNA H19介导香烟提取物诱导的肺泡巨噬细胞效应研究

目的探索右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)通过长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)H19对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的RAW264.7巨噬细胞活力、凋亡和自噬的影响。方法制备CSE及CSE干预巨噬细胞模型,运用体外细胞培养,DEX以不同浓度(2、4和8μmol/L)作用于CSE诱导的巨噬细胞,采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测模型细胞的凋亡率,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2及自噬相关蛋白LC3Ⅱ和ATG7表达情况,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测H19表达水平;为了进一步验证DEX对CSE诱导的巨噬细胞增殖、凋亡和自噬影响,运用双酶切法构建pcDNA3.1-H19表达载体。结果一定剂量的DEX可明显拮抗CSE诱导的巨噬细胞活力下降作用(P<0.05),具有浓度依赖性;DEX抑制CSE诱导的巨噬细胞凋亡,且细胞中凋亡蛋白Bax明显下调(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2上调(P<0.05),自噬相关蛋白LC3Ⅱ和ATG7表达上调(P<0.05),H19表达下调(P<0.05);成功构建pcDNA3.1-H19表达载体,DEX作用于CSE诱导的巨噬细胞,细胞活力明显降低(P<0.05),且细胞中凋亡蛋白Bax上调(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2下调(P<0.05),自噬相关蛋白LC3Ⅱ和ATG7表达下调(P<0.05)。结论DEX抑制H19表达,增强CSE诱导的巨噬细胞活力,抑制细胞凋亡和自噬。     

The regulation of N-terminal Huntingtin (Htt552) accumulation by Beclin1

Aim:

Huntingtin protein (Htt) was a neuropathological hallmark in human Huntington''s Disease. The study aimed to investigate whether the macroautophagy regulator, Beclin1, was involved in the degradation of Htt.

Methods:

PC12 cells and primary cultured brain neurons of rats were examined. pDC316 adenovirus shuttle plasmid was used to mediate the expression of wild-type Htt-18Q-552 or mutant Htt-100Q-552 in PC12 cells. The expression of the autophagy-related proteins LC3 II and Beclin1, as well as the lysosome-associated enzymes Cathepsin B and L was evaluated using Western blotting. The locations of Beclin1 and Htt were observed with immunofluorescence and confocal microscope.

Results:

Htt552 expression increased the expression of LC3 II, Beclin1, cathepsin B and L in autophagy/lysosomal degradation pathway. Treatment with the autophagy inhibitor 3-MA or the proteasome inhibitors lactacystin and MG-132 increased Htt552 levels in PC12 cells infected with Ad-Htt-18Q-552 or Ad-Htt-100Q-552. The proteasome inhibitor caused a higher accumulation of Htt552-18Q than Htt552-100Q, and the autophagy inhibitor resulted in a higher accumulation of Htt552-100Q than Htt552-18Q. Similar results were observed in primary cultured neurons infected with adenovirus. In Htt552-expressing cells, Beclin1 was redistributed from the nucleus to the cytoplasm. Htt siRNA prevented Beclin1 redistribution in starvation conditions. Blockade of Beclin1 nuclear export by leptomycin B or Beclin1 deficiency caused by RNA interference induced the formation of mHtt552 aggregates.

Conclusion:

Beclin1 regulates the accumulation of Htt via macroautophagy.     

去肾交感神经对2型糖尿病大鼠血管内皮细胞自噬及NLRP3活化的影响

目的 探讨去肾交感神经（RDN）对2型糖尿病（T2DM）大鼠血管内皮细胞自噬及核苷酸结合寡聚化结构域受体蛋白3（NLRP3）炎症小体活化的影响。方法 采用高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射制备T2DM大鼠模型。采用随机数字表法分为对照组（CON组）、糖尿病对照组（T2DM组）、双侧假手术组（Sham组）、双...     

Study of the mechanism underlying the role of PINK1/Parkin in the formic acid-induced autophagy of PC12 cells

This study aimed to explore PINK1/Parkin's role in methanol metabolite formic acid-induced autophagy in PC12 cells and provide a theoretical basis for elucidating methanol-induced neurotoxicity. After treatment with different formic acid concentrations, we observed the morphology and mitochondria of PC12 cells. We used an ultra-micro enzyme kit to detect the mitochondrial Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase activities; a JC-1 kit to detect changes in the mitochondrial membrane potential (MMP); MDC staining to detect the autophagy levels; and western blotting to measure the expression levels of the mitochondrial marker protein COX IV and the autophagy-related proteins Beclin1, P62 and LC3II/LC3I, and the mitochondrial and cytoplasmic levels of PINK1, Parkin and P-Parkin. Compared with the control group, the mitochondrial diameters, the mitochondrial Na⁺-K⁺-ATP and Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase activities, the MMP, and the COX IV expression levels decreased significantly (P < 0.05). The fluorescence signal intensity (indicating autophagy); relative Beclin1 and LC3II/LC3I protein expression levels; and relative mitochondrial PINK1, Parkin and P-Parkin levels increased significantly, and the relative P62 protein expression levels and relative cytoplasmic PINK1, Parkin and P-Parkin levels decreased significantly (P < 0.05) compared with the control group. Thus, formic acid alters mitochondrial morphology, causes mitochondrial dysfunction, affects the PINK/Parkin pathway and, thus, activates the process of mitochondrial autophagy.