阿卡波糖补料发酵工艺的研究

目的:探索阿卡波糖的补料发酵工艺,以提高阿卡波糖的发酵水平.方法:在发酵的不同时间补入不同量的麦芽糖或麦芽糖与酵母提取物的复合料液.结果:单次补料,在48 h补入麦芽糖的效果最好,随着补糖量的增加,发酵单位逐渐提高,当补3%的麦芽糖时,发酵单位最高,48 h达到3 462 mg·L-1,比对照提高了21%.在发酵的36,48和60 h三次补入麦芽糖,每次补入1.2%,96 h发酵单位可达到3 644mg·L-1,比对照组提高了27.4%.在发酵的36,48和60 h三次补入麦芽糖(总量3.6%)和酵母提取物(总量0.125%),108 h发酵单位提高到3 768 mg·L-1,再增加酵母提取物的补入量,则引起菌体浓度增加,发酵单位显著降低.结论:在发酵的30～60 h,单次或多次补入3.0%～3.6%的麦芽糖可以显著提高阿卡波糖的发酵单位;在补麦芽糖的同时补入少量的酵母提取物有助于维持菌体的正常代谢,延长发酵周期和提高发酵单位,但酵母提取物补入量超过0.25%时,则明显刺激菌体的生长,而抑制阿卡波糖的生物合成.     

响应面法优化阿卡波糖发酵培养基

目的利用响应面法对阿卡波糖发酵培养基进行优化。方法以HPLC法检测发酵样品中的阿卡波糖峰面积,并以阿卡波糖发酵单位为指标,通过Plackett-Burman(PB)实验,筛选出阿卡波糖发酵的主要影响因素,进而进行最陡爬坡实验,最后通过Box-Behnken设计实验,利用Design-Ex-pert 7.1.6 Trail软件进行回归分析,确定主要影响因素的最佳浓度,得到阿卡波糖优化发酵培养基组成。结果确定了优化发酵培养基组成(g.L-1):麦芽糖80.0、葡萄糖23.0、黄豆饼粉24.7、玉米浆1.5、谷氨酸1.0、磷酸二氢钾1.5、三氯化铁1.0、氯化钙3.0、碳酸钙4.0。验证实验表明在优化培养基条件下阿卡波糖发酵单位为4 015 mg.L-1,与预测值4 047 mg.L-1接近,比优化前提高了14.3%。结论对阿卡波糖发酵培养基采用响应面Box-Behnken设计,可以有效地对发酵培养基进行优化。     

碳源物质对阿卡波糖生物合成的影响

目的探索游动放线菌中阿卡波糖生物合成与发酵培养基中碳源物质的关系 ,进一步优化阿卡波糖发酵培养基的组成。方法采用不同的碳源物质组成发酵培养基 ,并测定阿卡波糖发酵过程中碳源物质消耗与阿卡波糖生物合成的关系。结果发现麦芽糖和葡萄糖组成的混合碳源是最适的碳源物质 ,并且葡萄糖和麦芽糖是按照 1∶1的质量比被菌体摄取用于阿卡波糖的生物合成。结论这些发现为阿卡波糖发酵培养基的优化和发酵过程中补糖工艺的控制提供了理论依据     

阿卡波糖生物合成和发酵工艺研究进展

阿卡波糖是治疗Ⅱ型糖尿病的一线药物.其在游动放线菌SE50中的生物合成过程是在由Acb基因群编码的一系列酶的催化作用下完成的,包括氨基环醇的生成,4-氨基-4,6-二脱氧葡萄糖的合成和之后的糖基化作用生成阿卡波糖.以游动放线菌作为阿卡波糖的产生菌时可以通过控制培养液中麦芽糖的浓度和发酵液的渗透压来提高阿卡波糖的产量.组分C是在发酵的后期由阿卡波糖直接转化而来的,给下游的分离纯化造成了困难,如在发酵液中添加微量的阿卡波糖类似物抑制剂可转化这一反应,其中Valienamine显示了最大的抑制作用.     

阿卡波糖发酵代谢阶段性溶氧控制的研究与应用

摘要：目的 研究摇瓶发酵不同阶段含氧量变化对阿卡波糖工业生产菌种犹他游动放线菌阿卡波糖合成的影响,以建立溶氧控制策略提高其阿卡波糖发酵水平。方法 通过调整摇瓶转速以及降低补料浓度和增加补料量调控溶氧水平,确定发酵过程中溶氧控制对犹他游动放线菌阿卡波糖发酵水平的影响。结果 建立了基于提高发酵后期摇床转速并同时降低补料浓度的溶氧控制策略,阿卡波糖效价达到8307 μg/mL,较对照提升了11.98%。结论 通过溶氧控制可以明显提高犹他游动放线菌阿卡波糖发酵水平,结果为进一步提高阿卡波糖工业发酵水平和降低生产成本提供了基础。 关键词：阿卡波糖;发酵;溶氧控制;优化     

硫酸铵与pH对酵母高密度发酵生产谷胱甘肽的影响

控制15L发酵罐中还原糖、氨基氮和pH,考察不同发酵模式对Candida utilis SIPI-60336生物合成谷胱甘肽(GSH)的影响.在高密度发酵模式中细胞产量和GSH产量同时达到最人值.确定发酵工艺为:在流加葡萄糖的基础上流加硫酸铵并控制pH,通过高密度发酵提高细胞浓度来提高GSH产量.最佳发酵条件为:还原糖浓度为10g/L,氨基氮浓度为60mg/100ml,pH 4.5.发酵48h后GSH产量和细胞干重均大幅提高,分别为830rng/L和41.5g/L.     

麦芽糖浓度和渗透压对游动放线菌生长及阿卡波糖生物合成的综合影响

阿卡波糖(1)是游动放线菌(Actinoplanes sp.)的次级代谢产物,其生成与菌体生长具有相关性.发酵液渗透压对细胞生长及1的生物合成影响显著.本研究考察了渗透压对1生物合成的影响,结果表明通过补料将发酵前期渗透压维持在300 mOsm/kg,中后期维持400～500 mOsm/kg,麦芽糖浓度维持6%,1生物合成水平大幅提高,50 L发酵罐效价为3 360mg/L,提高了50%以上.     

阿卡波糖片的亲水色谱法测定

建立了亲水色谱法测定阿卡波糖片的含量及其有关物质.采用Phenomenex氨基柱,以6 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.8)-乙腈(28:72)为流动相,检测波长210nm.阿卡波糖在4～20mg/ml浓度范围内线性关系良好.平均回收率为99.2%,RSD为0.7%.     

芳香族氨基酸添加提高井冈霉素产量的研究

目的 通过添加芳香族氨基酸促进井冈霉素生物合成起始单位的供应,提高其发酵产量.方法 优化苯丙氨酸添加时间和浓度确定最优添加条件,分析前体代谢相关的酶活考察其影响机制.结果 确定苯丙氨酸最佳添加条件为在发酵第24h添加0.1g/L.发现37℃时苯丙氨酸的添加提高了井冈霉素A产量,但在42℃条件下提高幅度大大降低.通过分析6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶活,发现芳香族氨基酸添加并未影响其酶活.结论 苯丙氨酸的添加能有效提高井冈霉素发酵产量近60％.苯丙氨酸的添加可能通过反馈抑制降低了戊糖磷酸途径中中间体的消耗,从而为井冈霉素合成提供了更加充足的7-磷酸景天庚酮糖.     

阿卡波糖和二甲双胍治疗糖耐量减低的疗效比较

目的 观察阿卡波糖和二甲双胍治疗糖耐量减低的疗效.方法 糖耐量减低患者82例,随机分为两组,阿卡波糖组41例给予阿卡波糖50～100 mg,3次/d;二甲双胍组41例给予盐酸二甲双胍250～500 mg,3次/d,疗程共12个月.治疗前及疗程结束后测空腹及餐后2h血糖、血脂(总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇)和体重指教BMI.结果 治疗后两组空腹及餐后2h血糖较治疗前均显著下降(P＜0.05和P＜0.01),但对餐后2h血糖控制阿卡波糖组[(6.82±0.24)mmol/L]优于二甲双胍组[(7.85±0.42)mmol/L](P＜0.01).2组均有调节血脂功能,无显著差异.二甲双胍在减轻体重方面优于阿卡波糖(P＜0.05).结论 阿卡波糖和二甲双胍均能降低餐后血糖,并能调节血脂,可用于糖耐量减低的治疗.     

波长切换HPLC法同时测定元和正胃片中5种成分的含量

目的建立RP-HPLC法同时测定元和正胃片中龙胆苦苷、甘草苷、甘草酸、芦荟大黄素、大黄酸5种成分的含量。方法采用Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5μm)进行分离;流动相为乙腈(A)-体积分数0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1;检测波长为0～35 min、276 nm,35～61 min、254 nm;柱温30℃。结果龙胆苦苷、甘草苷、甘草酸、芦荟大黄素、大黄酸质量浓度分别在29.4～294 mg·L-1(r=0.999 5,n=6)、4.35～43.5 mg·L-1(r=0.999 3,n=6)、8.25～82.5 mg·L-1(r=0.999 7,n=6)、1.27～12.7 mg·L-1(r=0.999 3,n=6)、0.68～6.8 mg·L-1(r=0.999 7,n=6)内与峰面积呈良好的线性关系,方法的平均回收率分别为99.5%(RSD=1.6%)、100.1%(RSD=1.4%)、99.4%(RSD=1.5%)、98.9%(RSD=1.1%)和99.4%(RSD=1.5%)。结论该方法简便、准确、重现性好、专属性强,可用于元和正胃片的质量控制。     

RP-HPLC法检测发酵液中利普司他汀的效价

目的建立奥利司他中间体利普司他汀发酵效价的检测方法。方法采用RP-HPLC法。色谱柱为Ultimate ODS硅胶柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-水(体积比4∶1),柱温为35℃,进样量为10μL,流速为1.1 mL·min-1,检测波长为210 nm。结果发酵70、100和130 h时测得发酵液中利普司他汀效价分别为2.518、4.323、6.981 g·L-1。结论该方法可有效地检测发酵液中利普司他汀效价。     

高效液相色谱-二极管阵列检测法同时测定消栓通胶囊中5种活性成分含量

目的采用高效液相色谱-二极管阵列检测法同时测定消栓通胶囊中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA共5种活性成分的含量。方法采用Kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,3.5μm);以甲醇-乙腈(体积比2∶1)(A)和体积分数0.1%磷酸水溶液(B)作流动相,流速1.0 mL.min-1,梯度洗脱;柱温30℃;检测波长羟基红花黄色素A为400 nm,芍药苷、阿魏酸为230 nm,丹酚酸B、丹参酮ⅡA为270 nm。结果羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA的线性范围分别为5.16～51.6 mg·L-1(r=0.999 1)、26.52～265.2 mg·L-1(r=0.999 5)、2.04～20.4 mg·L-1(r=0.999 6)、28.20～282.0 mg·L-1(r=0.999 1)、2.40～24.0 mg·L-1(r=0.999 2),5种成分的平均加样回收率为98.2%～101.7%,RSD为0.9%～2.1%(n=6)。结论建立的方法专属、准确、重现,可用于消栓通胶囊的质量控制。     

RP-HPLC法测定板栗种仁中原儿茶酸、对羟基苯甲酸和异香草酸的含量

目的建立同时测定板栗种仁中原儿茶酸、对羟基苯甲酸、异香草酸含量的方法。方法采用Dikma Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-体积分数为0.05%的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL.min-1,检测波长为260 nm,柱温为室温。结果原儿茶酸?对羟基苯甲酸、异香草酸质量浓度分别在10~100 mg.L-1?5~50 mg.L-1?50~500 mg.L-1内与峰面积具有良好的线性关系(r≥0.999 8,n=6),方法平均回收率分别为98.5%?98.0%?99.6%。结论本方法可用于同时测定板栗种仁中原儿茶酸?对羟基苯甲酸、异香草酸的含量。     

RP-HPLC法同时测定白英中绿原酸及咖啡酸的含量

目的建立RP-HPLC法同时测定白英药材中绿原酸、咖啡酸含量的方法。方法色谱柱为Di-amonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-体积分数0.05%的磷酸水溶液(体积比25∶75),检测波长327 nm,柱温45℃,流速1.0 mL.min-1。结果绿原酸质量浓度在0.5~32.0 mg.L-1(r=0.999 9)内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为99.9%,RSD为1.52%。咖啡酸质量浓度在10.0~640.0μg.L-1(r=0.999 9)内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为99.9%,RSD为1.35%。结论该方法简便、准确、重复性良好,可用于白英药材的质量控制。     

RP-HPLC法同时测定茵陈中5种化学成分的含量

目的建立同时测定茵陈中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量的方法,为茵陈药材的质量控制提供依据。方法采用RP-HPLC法。色谱柱:LunaC18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-体积分数0.04%磷酸水溶液(体积比17∶83);检测波长:345 nm。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷质量浓度分别在0.942~18.84 mg.L-1(r=0.9995)、1.190~23.79 mg.L-1(r=0.9995)、1.107~22.14 mg.L-1(r=0.9994)、56.78~1.136×103mg.L-1(r=0.9990)、0.621 9~12.44 mg.L-1(r=0.9998)内与峰面积呈良好的线性关系(n=5);方法回收率(n=9)分别为98.1%、100.7%、98.4%、100.2%、101.7%。结论该方法可用于茵陈药材的质量控制。     

RP-HPLC法同时测定人参提取物转化产物中20(S)、20(R)-人参皂苷Rg2和20(S)、20(R)-人参皂苷Rh1的含量

目的建立同时测定人参提取物转化产物中20(S)、20(R)-人参皂苷Rg2和20(S)、20(R)-人参皂苷Rh1含量的方法。方法采用RP-HPLC法。色谱柱为迪马C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-水梯度洗脱,检测波长为203 nm,流速为1.0 mL.min-1,柱温为30℃。结果人参提取物转化产物中20(S)、20(R)-人参皂苷Rg2和20(S)、20(R)-人参皂苷Rh1质量浓度分别在4.0~80 mg.L-1、2.8~56 mg.L-1、3.2~64 mg.L-1、2.4~48 mg.L-1内与峰面积呈良好的线性关系,相关系数分别为0.999 8、0.999 8、0.999 1、0.999 7,回收率分别为100.3%、98.1%、98.0%、99.9%,回收率的RSD值分别为3.1%、2.7%、4.7%、4.0%。结论方法准确、可靠、重现性好,为人参提取物转化产物的质量控制提供参考依据。     

HPLC法测定L-肌肽中的游离氨基酸的含量

目的采用柱前衍生高效液相色谱法对L-肌肽原料药中的游离氨基酸进行测定。方法采用异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)柱前衍生高效液相色谱法,使L-肌肽中游离的β-丙氨酸和L-组氨酸衍生物达到完全分离,并测定其含量。色谱柱为DiamonsilTM C18(200 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-0.05 mol.L-1醋酸钠溶液(体积比为13∶87),流速为1.0 mL.min-1,检测波长为254 nm,柱温为35℃。结果HPLC法测定β-丙氨酸和L-组氨酸的线性范围分别为2.01～20.10 mg.L-1(r=0.999 7)和2.00～20.00 mg.L-1(r=0.999 3);平均回收率分别为110.6%和98.2%。结论HPLC法无需专业的氨基酸分析仪,可用于L-肌肽中游离氨基酸的检查。     

HPLC法同时测定大株红景天中红景天苷、酪醇和没食子酸的含量

目的建立同时测定大株红景天中红景天苷、酪醇和没食子酸含量的方法。方法采用HPLC法。色谱柱为Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈-体积分数0.03%磷酸水溶液(体积比7∶93);检测波长为220 nm;流速为1.0 mL.min-1。结果红景天苷、酪醇和没食子酸质量浓度分别在4.100~121.9 mg.L-1(r=0.999 9,n=6)、1.10~31.9 mg.L-1(r=0.999 8,n=6)、2.00~60.7 mg.L-1(r=0.999 9,n=6)内与峰面积呈良好的线性关系。平均回收率(n=9)分别为99.1%、98.9%和103.0%,RSD分别为3.0%、2.1%和0.8%。结论本方法快捷、简便,结果准确、可靠、重复性好,可作为大株红景天药材中红景天苷、酪醇和没食子酸的测定方法。     

HPLC法同时测定野葛花中4种异黄酮成分的含量

目的建立野葛花中葛花苷、尼泊尔鸢尾异黄酮、鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷、鹰嘴豆芽素A4种异黄酮成分含量测定方法。方法采用HPLC法。色谱柱为Kromasil C18柱(200 mm×4.6 mm,5μm),以体积分数为1%的乙酸水溶液-甲醇-乙腈为流动相,线性梯度洗脱,流速为0.8 mL.min-1,检测波长为254 nm,柱温35℃。结果葛花苷、尼泊尔鸢尾异黄酮、鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷、鹰嘴豆芽素A质量浓度分别在42.8~856 mg.L-1、9.12~182.4 mg.L-1、13.2~264 mg.L-1、4.20~840 mg.L-1内呈良好线性关系,相关系数分别为0.999 9、0.999 9、0.999 1、0.999 3,平均回收率分别为100.7%(RSD=2.2%,n=9)、99.1%(RSD=2.4%,n=9)、98.6%(RSD=1.6%,n=9)和98.3%(RSD=1.5%,n=9)。结论该方法简便、准确、重现性好,可用于野葛花的质量控制。不同花期和不同药用部位的野葛花中4种指标成分的含量差异较大。