赤芍拮抗内毒素活性物质的分离及生物学活性研究

目的 通过生物传感器技术，应用常规分离技术寻找赤芍中的非鞣质类的抗LPS活性成分。方法 以生物传感器技术和薄层色谱技术为指导，建立赤芍抗LPS成分的有效提取方法。再利用高效液相色谱技术（HPLC）从赤芍中定向分离出具有拮抗LPS作用的活性组分。最后对其进行拮抗LPS活性的药理学评价。结果 利用生物传感器技术完成了对不同产地和不同煎煮方法的赤芍拮抗LPS活性的筛选，确定出醇提法的四川的赤芍中拈抗LPS活性成分的含量最高。并从中定向分离出6个具有与Lipid A结合活性的组分。     

大黄拮抗CpG DNA有效成分的分离制备及活性研究

目的：脓毒症是感染因素介导的全身炎症反应综合征,至今无有效的治疗手段。细菌Cp6DNA是引起脓毒症的主要病原分子。CpGDNA通过与TLR9结合,介导单核／巨噬细胞的活化,是介导脓毒症发生的重要途径。本研究以CpGDNA为靶点,从中药中定向分离具有拮抗CpGDNA和治疗脓毒症作用的活性物质。方法：（1）应用生物传感器技术、建立以CpGDNA为靶点的筛选抗炎中药的技术平台并对78种中药进行筛选;（2）利用生物传感器技术、硅胶柱层析、离子交换柱层析技术,从大黄中定向分离与CDGDNA具有较高结合活性的组分,并对得到的组分进行初步的活性评价,确定活性组分;（3）在体外实验中,测定活性组分与CpGDNA、lipidA的结合能力,观察活性组分对LPS、CpGDNA刺激小鼠RAW264．7细胞分泌炎症介质的抑制作用,在体内实验中,观察活性组分对致死剂量热灭活大肠杆菌攻击小鼠的保护作用。（4）利用反相HPLC技术对活性组分进行制备分离,获得活性单体化合物;（5）在体外实验中,检测单体化合物与CpGDNA和lipidA的结合能力．观察化合物对LPS、CpGDNA刺激小鼠RAW264．7细胞分泌炎症介质的抑制作用。结果：（1）建立了以CpGDNA为靶点应用生物传感器筛选抗炎中药的技术平台;从78种中药中筛选出大黄等14种中药与CpGDNA具有较高结合能力;（2）利用生物传感器技术、硅胶柱层析、离子交换柱层析等技术从大黄水提物中定向分离得到与CpGDNA有较高结合活性大黄D组分;（3）在体外,大黄D组分与CpGDNA、LipidA均具有较高的结合活性,对CpGDNA及LPS刺激小鼠RAW264．7细胞分泌TNF-α有显著的抑制活性,并呈现良好的量一效关系。在体内,大黄D组分对致死剂量的热灭活大肠杆菌攻击小鼠有显著的保护作用,并呈现良好的量-效关系;（4）通过反相HPLC从D组分中分离得到单体化合物大黄酸和大黄素;（5）在体外,大黄酸和大黄素与CpGDNA均具有较高结合能力,均能单独或协同对CpGDNA及LPS刺激RAW264．7细胞分泌TNF—Q产生显著抑制作用。结论：（1）应用生物传感器、以病原分子CpG DNA为靶点,成功地建立了筛选抗炎中药的技术平台;（2）从大黄中分离得到与CpGDNA有较高结合活性的大黄D组分,体内、外生物学活性评价结果显示：大黄D组分对CpGDNA及LPS刺激小鼠RAW264．7细胞分泌TNF—α具有显著的抑制活性,并对致死剂量的热灭活大肠杆菌攻击小鼠有显著的保护作用;（3）从大黄D组分中分离得到单体化合物大黄酸和大黄素,生物学活性评价结果显示,大黄酸和大黄素对CpGDNA及LPS刺激小鼠RAW264．7细胞分泌TNF—α具有显著的抑制活性,提示大黄酸和大黄素可能是D组分以及大黄提取物拮抗cpGDNA和脓毒症的主要物质基础。     

中药赤芍抗内毒素活性的实验观察

目的：通过提取中药赤芍中抗内毒素（LPS）活性的有效成分,进行药理学观察,探讨赤芍抗内毒素活性的内在机制。方法：将常规中药化学分离技术与生物传感器相结合,分离赤芍抗LPS的有效成分,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和鲎试验法检测该有效成分对LPS的中和作用。结果：赤芍中抗LPS的有效成分具有较强的中和LPS的活性．该有效成分能够在体外实验中显著抑制由LPS介导的培养细胞系释放TNF-α。结论：中药赤芍中存在高活性的抗LPS有效成分．该成分可以LPS为靶点,应用常规中药化学分离技术与生物传感器相结合的方法进行快速、有效地提取分离。     

赤芍拮抗内毒素活性的实验研究

目的:提取分离中药赤芍中拮抗内毒素(LPS)的有效成分并进行药理学活性检测。方法:通过生物传感器,结合常规的中药分离技术,分离提取出赤芍拮抗LPS的有效成分,应用鲎实验和ELISA法检测该有效成分对LPS的中和作用。结果:赤芍中的有效成分与LPS具有较高的结合作用,该结合作用具有较强的中和LPS活性,在体外能够显著抑制由LPS介导小鼠RAW 2 6 4.7细胞释放TNF α。结论:以LPS为靶点,应用生物传感器技术,可快速、有效地提取分离赤芍中具有较强的中和LPS活性的有效成分。     

以Lipid A为靶点拮抗内毒素中药的筛选

目的利用生物传感器跟踪技术从抗炎中药中筛选出具有拮抗内毒素的中药,为进一步对中药拮抗内毒素活性成分的分离纯化提供实验依据。方法将革兰阴性细菌的脂质A(Lipid A)包被于生物传感器的非衍生板建立靶点,跟踪测定赤芍、大黄、黄芩等78种中药的水提物和醇提物与Lipid A的结合活性,再将筛选出的中药去鞣质后与定量的内毒素(LPS,20、50ng·ml-1)37℃孵育30min后,测定孵育后的样品与Lipid A的结合情况,以评价样品内的活性物质含量。结果在所筛选的78种中药中有12种中药的水提物与Lipid A具有较高的亲和活性,在这12种中药中有6种中药的醇提物与Lipid A也具有较高的亲和活性;通过对所筛选出的12种中药的水提物去除鞣质后与LPS的消耗实验,发现所筛选出的12种中药均含有除鞣质以外的与lipid A具有特异性结合的物质,并且12种中药中能与Lipid A发生特异性结合作用的活性物质含量存在较大的差异。结论生物传感器跟踪技术是一种快速、准确、有效的筛选平台,筛选出的12种中药均含有非鞣质类能与lipid A发生特异性结合作用的物质,为进一步对12种中药抗内毒素有效部位或单体的分离提供了重要的实验依据。     

生物传感器技术在筛选赤芍中抗内毒素有效成分的应用研究

目的 :应用生物传感器技术优选赤芍中抗内毒素有效成分的提取方法。方法 :将内毒素包被于生物传感器的疏水样品池中 ,测定赤芍3种方法提取物与内毒素的亲合力及其与内毒素混合孵育后内毒素亲合力的变化。结果 :水浸法提取物与内毒素具有较高的亲合力 ,以1∶40稀释后能够中和78 1 %的内毒素。结论 :赤芍水浸法能够提取到更多的抗内毒素有效成分 ,测定结果与鲎试剂法一致 ;与传统的鲎试剂法比较 ,生物传感器技术具有快速、高效、直观、无干扰等优点。     

黄芩药材中2’，5，6＇,7-四羟基二氢黄酮醇的分离与鉴定

目的：分离并鉴定黄芩药材中2＇,5,6＇,7-四羟基二氢黄酮醇。方法：依托以LipidA为靶点的抗内毒素（LPs）药物筛选平台,应用大孔吸附树脂、膜和高效液相色谱法对黄芩水提液进行针对LipidA的逐级分离纯化,对所得目标化合物采用质谱、核磁共振和红外光谱等技术进行结构解析。结果：从黄芩水提液中分离出活性化合物5KL-1B,其与LipidA的特异性结合值为208．6arc seconds,结构鉴定确证5KL-1B为2＇,5,6＇,7-四羟基二氢黄酮醇。结论：本试验建立的定向分离模式目的性强、效率高,可用于天然药物中抗LPS活性物质的富集与分离纯化。     

黄芩药材中2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇的分离与鉴定

目的:分离并鉴定黄芩药材中2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇。方法:依托以Lipid A为靶点的抗内毒素(LPS)药物筛选平台,应用大孔吸附树脂、膜和高效液相色谱法对黄芩水提液进行针对Lipid A的逐级分离纯化,对所得目标化合物采用质谱、核磁共振和红外光谱等技术进行结构解析。结果:从黄芩水提液中分离出活性化合物5KL-1B,其与LipidA的特异性结合值为208.6arc seconds,结构鉴定确证5KL-1B为2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇。结论:本试验建立的定向分离模式目的性强、效率高,可用于天然药物中抗LPS活性物质的富集与分离纯化。     

以CpG ODN为靶点应用生物传感器技术筛选抗炎中药

目的:筛选具有拮抗CpGODN作用的抗炎中药。方法:将CpGODN包被于生物传感器的生物素化样品池上,测定78种中药水煎液与CpGODN的亲和力;选择具有较高亲和力的中药水煎液,与CpGODN(33μg·ml-1)37℃孵育30min后,再次测定与CpGODN的亲和力。结果:78种中药中,地榆、大黄、藏青果等14种中药含有结合CpGODN的活性成分;鸦胆子、赤芍、地榆等9种中药活性成分含量较高。结论:筛选得到9种活性含量较高的中药,为下一步分离提纯有效成分单体提供了实验依据。     

罗布麻叶黄酮类化合物的分离提取及对体外皮质酮损伤的保护作用评价

目的:应用高速逆流色谱分离提取罗布麻叶中的黄酮类化合物,并对所分离的成分进行定性和定量检测及抗抑郁活性评价。方法:以溶剂配比为乙酸乙酯-乙腈-水-醋酸(5∶0.8∶5∶0.02)作为制备型逆流色谱分离的溶剂系统,并利用高效液相色谱对所分离的成分进行定性和定量检测,用pc-12细胞进行抗抑郁活性评价。结果:应用高速逆流色谱技术一次性分离得到4个黄酮类单体化合物,分别为白麻苷、乙酰化金丝桃苷、三叶豆苷和紫云英苷,经高效液相色谱检测其纯度均达到95%,同时得到2个混合物组分,分别为金丝桃苷/异槲皮素组和槲皮素/山柰酚组。罗布麻叶单体黄酮及粗提物均具有抗抑郁活性。结论:应用高速逆流色谱分离单体化合物具有方法简单,方便快捷的特点,所分离的单体化合物抗抑郁活性较强,具备进一步开发的价值,且各单体化合物及组分的抗抑郁活性有一定的规律。     

~(60)钴-γ射线对赤芍药材有效成分的影响

目的:研究赤芍药材经60钴-γ射线辐照前、后有效成分的变化。方法:采用高效液相色谱法测定受辐照前、后赤芍药材中芍药苷的含量,色谱柱为Spherigel ODS C18(150mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-水(梯度洗脱),检测波长为260.5nm。结果:赤芍药材经60钴-γ射线辐照后芍药苷的含量降低了近20%。结论:在处理含赤芍药材的中药制剂时应考虑到辐照对主成分的影响。     

The screening and isolation of an effective anti-endotoxin monomer from Radix Paeoniae Rubra using affinity biosensor technology

Lipopolysaccharide (LPS) is a known trigger in the pathogenesis of sepsis, lipid A being the toxic component. One of several adjuvant therapeutic approaches for severe sepsis is currently focusing on the neutralization of LPS. In order to obtain the components from traditional Chinese herbs that can neutralize the endotoxin, aqueous extractions were tested using affinity biosensor technology. From amongst 42 herbs, eight were found to possess lipid A-binding abilities. Radix Paeoniae Rubras had the highest lipid A-binding ability; therefore an aqueous extraction from this plant was investigated further. After preparation using standard methods, including silica gel chromatography and HPLC, we obtained 1, 2, 3, 4, 6-beta-d-pentagalloylglucose (PGG), with lipid A-binding ability. It was found that in vitro, PGG directly bound to lipid A, with a Kd of 32 microM, and that it neutralized the endotoxin both in the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay and in a TNF-alpha release experiment, in a dose-dependent manner. In in vivo experiments, PGG was found to protect mice from a lethal challenge by LPS, and significantly decreased the plasma endotoxin level both in endotoxemic mice and rats, the reduction of the endotoxin level in rats being tightly associated with the TNF-alpha level. In conclusion, we demonstrate the effectiveness of affinity biosensor technology in discovering useful agents amongst traditional Chinese herbs and using this approach we found a new anti-endotoxin agent.     

芍药及不同炮制品在芍药甘草汤中芍药苷含量的差异研究

目的:研究芍药甘草汤(SGT)中配伍不同芍药炮制品对芍药苷含量的影响。方法:采用高效液相色谱(HPLC)法测定赤芍、白芍等在SGT中使用时芍药苷的含量。色谱柱为SHIMA-DCIS ODSC18,流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85),检测波长为230nm,流速为1.0mL·min-1。结果:SGT中芍药苷含量为赤芍>酒炙白芍>炒白芍>去皮白芍>白芍。结论:赤芍、酒炙白芍、白芍分别配伍SGT时,其芍药苷含量有显著差异,提示SGT在临床加减使用时应根据不同证候区别使用赤芍、白芍及白芍炮制品。     

基于多基原及系统聚类分析研究赤芍标准汤剂的指纹图谱

目的： 建立赤芍标准汤剂的HPLC双波长指纹图谱，区分不同基原赤芍指纹图谱，采用相似度、SPSS系统聚类分析和主成分因子分析，对赤芍标准汤剂的类别及成分进行分析研究，全面、快速地为其质量评价提供重要依据，保证赤芍标准汤剂原质原味。方法： 采用高效液相色谱法-双波长及梯度洗脱法，建立赤芍标准汤剂对照指纹图谱以及川赤芍、白芍特征图谱；色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，检测波长：前25 min为210 nm，之后换为230 nm，柱温30℃。结果： 建立了赤芍标准汤剂对照指纹图谱，确定8个共有特征峰，指认了4个峰。使用指纹图谱区分了川赤芍、白芍与赤芍不同基原之间的特征性成分。通过系统聚类分析，将15批不同产地样品聚为3类，共提取两大主成分，累积方差贡献率高达86.176%。结论： 不同基原、产地之间的赤芍标准汤剂存在一定差异。通过指纹图谱方法和化学计量学方法可以快速对基原、类别、成分进行分析，具有化学成分的追溯性，对不同基原原料及终端产品进行原质源头保证，可为赤芍配方颗粒的全面质量控制和质量评价提供重要参考依据。     

清胃黄连片的质量标准

目的:建立清胃黄连片的质量控制标准。方法:采用薄层色谱法对清胃黄连片中黄芩、黄连、黄柏、甘草、知母、桅子、赤芍进行定性鉴别,采用高效液相色谱法对清胃黄连片中的黄芩苷进行含量测定。结果:黄芩、黄连、黄柏、甘草、知母、桅子、赤芍可在不同的薄层条件下分别检出;利用高效液相色谱法测定制剂中黄芩的有效成分黄芩苷,黄芩苷在0.20～1.60μg范围内线性关系良好(r=0.999 8),平均回收率为98.46%,RSD为2.89%(n=6)。结论:该法专属性强,重复性好,可用于清胃黄连片的质量控制。     

抗纤胶囊质量标准的研究

目的建立抗纤胶囊的质量标准。方法采用薄层色谱法对抗纤胶囊中苦参、赤芍进行定性鉴别;采用高效液相色谱法测定制剂中的粉防己碱,色谱柱为:Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,5μm)分析柱;流动相:甲醇-三乙胺溶液(3.5→500)(80∶20),流速:0.9mL·min;检测波长:283nm。结果薄层色谱法具有专属性,高效液相色谱法准确可靠,粉防己碱在进样量0.09282～2.7846μg范围内线性关系良好,回归方程为Y=735786X-428.14,r=1.0000(n=10),平均回收率为99.11%,RSD为1.89%。结论该法可作为抗纤胶囊的质量控制标准。     

赤芍不同提取物抑制ras突变的肿瘤活性谱效关系研究

目的： 建立赤芍不同提取部位高效液相色谱（HPLC）指纹图谱,探讨其抑制ras突变肿瘤活性的谱效关系,为明确其抗肿瘤作用及物质基础提供参考。方法： 分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇对赤芍水煎液进行萃取,并采用HPLC法对提取物进行分析,建立色谱图;采用秀丽隐杆线虫检测各有效部位的急性毒性及抗肿瘤活性;采用偏最小二乘（PLS）回归分析研究其谱效关系。结果： 赤芍醋酸乙酯部位的急性毒性高于正丁醇部位和石油醚部位;赤芍3个部位均不同程度地提高了线虫的野生型比例,且正丁醇部位效果最好;谱效关系研究表明,色谱峰7、5（芍药苷）、1所对应化合物对抑制ras突变的肿瘤活性有重要作用。结论： 赤芍抑制ras突变的抗肿瘤活性是多种化学成分共同作用的结果,为赤芍作为抗肿瘤药物的开发研究提供了一定思路。     

赤芍片提取工艺的研究

目的:筛选赤芍片水煎提取的最佳工艺条件。方法:应用正交试验得到最佳提取条件。结果:赤芍加水首次10倍量,煎煮2小时。第二次加水8倍量,煎煮1小时。结论:此提取条件最佳。     

康瘫丸的质量标准

目的：建立康瘫丸的质量标准。方法：用薄层色谱法对康瘫丸中的黄芪、赤芍、羌活、当归进行定性鉴别;HPLC法测定制剂中芍药苷含量;检测波长230nm,流速1．0ml·min^-1。结果：薄层色谱斑点清晰,芍药苷在21．6～216．0μg·ml^-1浓度范围内线性关系良好（r=0．9999）,平均回收率为99．5％,RSD为1．15％（n=6）。结论：本方法简便、准确,可控制该制剂的质量。