紫苏属药用植物的rDNA ITS区SNP分子标记与位点特异性PCR鉴别

目的分析单种属——紫苏属各变种间rDNA ITS区的序列以及存在的单核苷酸多态性(SNP)现象，设计出位点特异性PCR引物，用于紫苏属各变种间的分子标记鉴别。方法对紫苏属各变种多个体的rDNA ITS区全序列进行了准确测定，运用Clustral X 1.8，MEGA 3.0进行排序并进行SNP分析，从而设计出鉴别各变种的等位基因位点特异性PCR鉴别引物。结果紫苏属各变种(紫苏、白苏、鸡冠苏和耳齿紫苏等)的rDNA ITS区全序列共有615～618 bp的长度，ITS1为233～235 bp，5.8S为179 bp，ITS2为203～204 bp，GC含量为61.5%～61.9%。从rDNA ITS区碱基变异的整体情况来看，紫苏属各变种间不仅在非编码的转录间隔区ITS1和ITS2内存在非编码区单核苷酸多态性(ncSNP)，而且在保守的5.8S编码区内也存在3个位点的单核苷酸多态性，即编码区SNP(cSNP)，所有的SNP均只具2等位多态性。5.8S区cSNP的出现与产生该变异的变种出现的显著形态差异关联。本文还利用这些SNP位点设计出了鉴别紫苏属各变种的位点特异性PCR引物，无需测序即可对紫苏属的原植物及“苏子”、“苏叶”等药材进行有效准确的分子鉴别。结论紫苏属药用植物rDNA ITS区存在的SNP可用作紫苏属各变种鉴别的分子标记。     

蒙药材草乌叶DNA条形码研究北大核心CSCD

目的:建立草乌叶与其易混品的分子鉴定方法。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对草乌叶及9种混伪品的候选序列(ITS、ITS2、matK、rbcL、psbA-trnH)进行扩增,比较各序列的扩增效率和测序成功率,并进行种内、种间遗传变异分析和barcoding gap分析。结果:ITS和ITS2序列GC含量较高,种间变异明显大于种内变异,根据barcoding gap图显示种内、种间遗传距离重叠较小,适合物种的区分,基于K2P距离进行聚类分析,ITS序列呈现较好的单系性。结论:ITS序列可应用于蒙药材草乌叶与其混伪品的鉴定,为民族药鉴定提供新方法。     

巴戟天饮片及其混伪品的鉴别研究

目的:基于DNA条形码技术、传统经验鉴别和理化鉴别技术区分巴戟天饮片及其混伪品。方法:通过聚合酶链式反应(PCR),对巴戟天的内部转录间隔区2(ITS2)序列进行扩增;通过与GenBank数据库进行BLAST比对,以及利用构建NJ树的方法推断巴戟天饮片及其混伪品的基原;比较巴戟天饮片及其混伪品的种内、种间差异;比较巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为差异。结果:巴戟天饮片及其混伪品经NJ树聚类分析和与GenBank进行BLAST比对,结果显示巴戟天饮片与其混伪品分支明显,11批巴戟天混伪品被鉴定到7个种,分别为印度羊角藤(羊角藤)、蔓虎刺、硃砂根、木通、黑老虎、合蕊五味子(铁箍散)、南五味子;种内、种间变异分析结果显示,5批巴戟天饮片的种内遗传距离为0.000,巴戟天饮片与其他7个混伪品的最小种间遗传距离为0.037;巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为存在差异。结论:基于DNA条形码技术可有效区分巴戟天饮片及其混伪品,为巴戟天饮片正伪品的鉴别以及标准提升工作提供了一定的依据。     

花椒及其混淆品的rDNA ITS区序列分析与鉴别

目的研究不同居群的花椒及其混淆品的rDNA ITS区碱基序列的特征及其差异，为花椒的鉴别提供可靠的分子标记。方法运用PCR产物直接测序和克隆测序法对甘肃、陕西、四川、河北等7个花椒居群及3个混淆种的rDNA ITS区(包括ITS1，5.8S，ITS2)碱基序列进行序列测定。结果首次报道花椒ITS区的碱基序列，序列总长度为619-620 bp，长度变异较少，与混淆种长度仅相差4 bp。花椒各居群中，rDNA ITS区碱基序列有15个变异位点、12个信息位点、3个特异性识别位点。与混淆品间的碱基差异则较为显著，多达71个变异位点，有4个花椒特异性识别位点。结论依据花椒ITS区的序列特征可准确鉴别各居群的花椒及其混淆品；亲缘关系密切的花椒居群在地理位置上也非常靠近；rDNA ITS序列特征可作为花椒种内和种间鉴别的有效分子标记。     

新生隐球菌ITS与IGS2基因的分类比较研究

目的探讨ITS及IGS2基因片段对新生隐球菌各变种及基因型分类与鉴定的应用价值。方法根据本课题前期研究结果及GenBank发表的基因序列资料,研究新生隐球菌3个变种的ITS和IGS2基因片段信息,用CLUSTERW软件构建以上两种基因的系统发育进化树并进行分析,了解其亲缘关系。结果对新生隐球菌各菌株ITS基因型的IGS2区域片段分析结果显示,IGS2基因片断具有丰富的变异和信息位点。同ITS基因序列比较显示,IGS2基因在亚种内也具有同步进化和变异的特征。结论IGS2基因序列分析可作为新生隐球菌种间及种内基因分类鉴定有效的分子生物学方法;多种基因分类鉴定方法的联合应用．可更有效和准确地鉴定新生隐球菌并揭示其种内不同基因亚型间的遗传进化关系。     

DNA条形码鉴定洋金花及其伪品

为建立有毒中药洋金花及其伪品DNA条形码鉴定方法,采用国际通用的条形码序列ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL对洋金花原植物白花曼陀罗及其伪品毛曼陀罗、曼陀罗和木本曼陀罗4个种共计20份材料进行了比较研究。PCR及测序成功率分别为ITS2(100%)、matK(100%)、psbA-trnH(90%)、rbcL(85%)。采用CodonCode Aligner进行序列拼接,采用MEGA 4.1计算白花曼陀罗及其伪品的种内、种间的K2P距离,并基于K2P模型构建NJ树。结果显示ITS2序列共有30个单核苷酸多态性(SNPs)位点、psbA-trnH序列有33个单碱基的插入和缺失I。TS2和psbA-trnH序列种间遗传距离大于种内,matK和rbcL种内和种间没有明显Barcoding Gap。4个条形码序列及其组合获得的分子系统树(ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL、matK+rbcL)均分成了两大支,木本曼陀罗单聚为一支,该分子证据支持将Brugmansia提升为属水平。实验结果表明ITS2及psbA-trnH序列可以作为洋金花及其伪品鉴定用的条形码序列。     

重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究

为评价DNA条形码候选序列对重楼属药用植物的鉴定作用, 探讨重楼属药用植物鉴定新方法, 本研究对重楼属11个物种17份样品的psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK和核ITS2序列进行PCR扩增和测序, 比较各序列扩增和测序效率、种内和种间变异, 进行barcoding gap分析, 采用BLAST1和Nearest Distance方法评价不同序列的鉴定能力。结果显示, ITS2序列在所研究的重楼属药用植物中的扩增和测序效率均为100%, 其种内种间变异、barcoding gap与其他DNA条形码候选序列相比具有明显的优势, ITS2序列在重楼属中的鉴定成功率达到100%, 而生物条形码协会 (CBOL) 植物工作组推荐的matK和rbcL序列的鉴定成功率分别为52.9% 和5.9%, 二者联合鉴定能力没有提高, 对于ITS2序列扩大至29个物种67份样品依然具有100%的鉴定成功率。实验结果表明, ITS2序列能够准确鉴定重楼属药用植物, 可以作为潜在的药用植物通用条形码序列。     

中药黄草石斛rDNA ITS序列分析

目的　研究黄草石斛ITS片段遗传多样性,分析该片段在黄草药材DNA分子鉴别和石斛属植物系统学研究中的意义。方法　用一对引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后用双脱氧终止法(Sangerdideoxy)测序。结果　获得核糖体DNA中ITS和5 8SrDNA完整序列,14个石斛类群的ITS 1与ITS 2序列的长度分别为228-233bp和242-247 bp。石斛种间ITS 1序列的差异百分率为11.79% - 31.58% ,ITS 2序列的差异百分率为10.29% - 25.30% ,金钗石斛种内ITS 1序列的差异百分率为0.87% ,ITS 2序列无差异。石斛各类群与外类群的差异百分率ITS 1序列为23.56% - 36.89% ,ITS 2序列为26.5.2 % - 33.31%。用NJ法根据ITS 1与ITS 2序列数据重建系统发生树。结论　两段序列在石斛种内保守,在种间有较大的差异,与外类群的差异最大,可作为中药黄草石斛分子鉴定的标记,而石斛属的系统发生关系尚须进一步研究     

芍药野生与栽培群体的遗传变异研究

目的探讨芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的野生群体和栽培群体之间的遗传分化与中药材赤芍和白芍道地性形成的关系。方法应用RAPD技术,使用21条随机引物对来自11个产地的43株有代表性的芍药样品进行PCR扩增。结果(1)芍药在物种水平上的多态位点比率为85.26%,基因多样度为0.166;其中野生群体(77.61%)高于药用栽培群体(54.96%)及观赏栽培群体(61.76%);(2)芍药群体间的遗传变异占总变异的29.50%,基因分化系数为0.254;野生与药用群体之间遗传距离最远(0.3632),药用与观赏群体之间遗传距离最近(0.0973),群体间遗传分化显著(P<0.001);(3)从聚类图看,芍药种内大致分为野生与栽培两大类群。在野生群体中来自多伦的芍药单独聚为一类;在药用栽培群体中产于安徽亳州的与产于浙江磐安、缙云的芍药各聚为一类。结论首次揭示了芍药种群的遗传分化,在分子水平上为赤芍和白芍道地性的形成找到依据。鉴于多伦产芍药(赤芍道地药材的主要来源)的种质资源面临灭绝的危险,建议列为濒危种质加以保护。     

ABCB1基因多态性与肾移植患者围手术期服用他克莫司相关不良反应的相关性

目的:探讨腺苷三磷酸(ATP)结合盒转运体B1(ABCB1)基因多态性与肾移植患者围手术期服用他克莫司相关不良反应的相关性。方法:选取2014年11月-2018年3月于我院行肾移植术且术后服用他克莫司的患者170例,检测其ABCB1 C1236T(rs1128503)、ABCB1 G2677T/A(rs2032582)和ABCB1 C3435T(rs1045642)基因型。采用χ2检验比较不同基因型患者间他克莫司相关不良反应的发生率,相关不良反应包括消化道反应、肺部感染、肾功能异常、肝功能异常、血糖升高、血脂升高、白细胞降低。采用Logistic回归模型进行单位点危险度分析。应用PHASE软件分析患者上述基因的主要单倍型,并分析其主要单倍型与他克莫司相关不良反应的相关性。结果:170例患者中,ABCB1 C1236T(rs1128503)检测结果显示CC型21例(占12.3%)、CT型78例(占45.9%)、TT型71例(占41.8%);ABCB1 G2677T/A(rs2032582)检测结果显示GG型25例(占14.7%)、GA+GT型95例(占55.9%)、AA+AT+TT型50例(占29.4%);ABCB1 C3435T(rs1045642)检测结果显示CC型57例(占33.5%)、CT型82例(占48.2%)、TT型31例(占18.3%)。不同ABCB1基因型患者间消化道反应、肺部感染、肾功能异常、血糖升高、血脂升高、白细胞降低的发生率差异均无统计学意义(P>0.05),但ABCB1 C1236T(rs1128503)及ABCB1 C3435T(rs1045642)不同基因型患者间肝功能异常的发生率差异有统计学意义(P<0.05),ABCB1 G2677T/A(rs2032582)不同基因型患者间肝功能异常的发生率差异虽无统计学意义(P=0.069),但P<0.1。Logistic回归分析显示,ABCB1 C1236T(rs1128503)CC型[OR=4.959,95%CI(1.700,14.468),P=0.003]、ABCB1 G2677T/A(rs2032582)GG型[OR=3.500,95%CI(1.164,10.524),P=0.026]以及ABCB1 C3435T(rs1045642)CC型[OR=3.033,95%CI(1.012,9.095),P=0.048]均为他克莫司致相关肝功能异常的风险因子。ABCB1 CGC单倍型为主要单倍型,其携带与否与他克莫司相关肝功能异常的发生率差异存在统计学意义(P=0.002),且是他克莫司相关肝功能异常的风险因子[OR=3.173,95%CI(1.512,6.656),P=0.002]。结论:携带ABCB1 CGC单倍型的肾移植患者围手术期服用他克莫司出现肝功能异常的可能性较大。     

2010-2020年巴戟天研究进展

目的:对2010-2020年期间巴戟天的研究进行整理归纳,了解其发展现状并对其发展前景进行展望。方法:通过文献研究,总结其在品种考证和资源分布、化学成分、质量标准、DNA分子条形码、炮制方法、提取工艺、含量测定等方面的研究进展。结果与结论:总结发现近10年巴戟天的研究取得了较大进展:确定了巴戟天的基原问题,探索部分化学成分的药理作用,完善巴戟天的药典标准;发现巴戟天在目前研究存在的一些难点问题,例如巴戟天的混伪品较多,建议构建巴戟天及其混伪品的基因库,有助于将其正本清源。通过对巴戟天的研究进行整理归纳为后续巴戟天的研究及开发利用提供参考,也为巴戟天药材的质量控制和药效物质基础研究奠定基础。     

Cytochrome b sequences in black-crowned night-herons (Nycticorax nycticorax) from heronries exposed to genotoxic contaminants

DNA sequence analysis of a 215 base-pair region of the mitochondrial cytochrome b gene was used to examine genetic variation and search for evidence of an increased mutation rate in black-crowned night-herons. We examined five populations exposed to environmental contamination (primarily PAHs and PCBs) and one reference population from the eastern U.S. There was no evidence of a high mutation rate even within populations previously shown to exhibit increased variation in DNA content among somatic cells as a result of petroleum exposure. Three haplotypes were observed among 99 individuals. The low level of variability could be evidence for a genetic bottleneck, or that cytochrome b is too conservative for use in population genetic studies of this species. With the exception of one population from Louisiana, pair-wise Phi_st estimates were very low, indicative of little population structure and potentially high rates of effective migration among populations.     

不同种质资源的巴戟天化学成分的指纹图谱研究

目的建立巴戟天含蒽醌类化学成分HPLC指纹图谱的分析方法,研究不同种质资源的巴戟天药材的质量。方法采用梯度洗脱的方法进行色谱分离,使用计算机辅助相似度评价软件进行数据处理,对不同种质资源的巴戟天药材指纹图谱的相似度进行比较分析。结果规范化种植基地巴戟天药材指纹图谱相似度较好,但不同种质资源的巴戟天药材指纹图谱有明显的差异。结论所用方法稳定,重复性好,可用于评价不同类型巴戟天药材的质量;不同种质资源的巴戟天药材含蒽醌类化合物化学组成相似,但相对比例有明显的差异。     

High genetic diversity in wild culinary-medicinal wood ear mushroom, Auricularia polytricha (Mont.) Sacc., in tropical China revealed by ISSR analysis

The genetic diversity of 40 wild Auricularia polytricha strains within ten natural populations in tropical China and five cultivated strains were analyzed by using twelve inter-simple sequence repeat (ISSR) primers. At the species level, the percentage of polymorphic loci (P) = 99.8%, the effective number of alleles (Ne) = 1.3569, Nei's gene diversity (H) = 0.2398, Shannon information index (I) = 0.3896, and total genetic diversity (Ht)= 0.2346 indicate a high level of genetic diversity in wild A. polytricha. At the population level of the wild fungus, P = 43.51%, Ne = 1.2675, H = 0.1702, I = 0.2504. However, the genetic diversity of cultivated strains was the lowest of all populations (Ne = 1.1584, H = 0.0940, I = 0.1440). A moderate degree of genetic differentiation (G(st) = 0.347) among the sampled wild populations was detected based on Nei's gene diversity analysis, suggesting that 65.3% of variation existed within this population. The high genetic variation level within wild populations may mostly result from a low level of gene flow (N = 0.9408) and random genetic drift.     

巴戟天根、茎、叶中甲基异茜草素、水晶兰苷、多糖的分布与积累研究

目的 测定巴戟天根、茎、叶中甲基异茜草素、水晶兰苷和多糖的含量,揭示其分布和积累规律.方法 分别采用HPLC法、紫外分光光度法,测定不同生长年限的巴戟天根、茎、叶中甲基异茜草素、水晶兰苷及多糖的含量.结果 种植2～6年的巴戟天根、茎、叶中甲基异茜草素的含量分别为2.61～9.98、0.69 ～ 3.87、0.11 ～0.41 μg·g-1;水晶兰苷的含量分别为9.1744～16.4693、8.4812 ～13.3430、14.1367 ～23.1610 mg·g-1;多糖的含量分别为76.8191 ～ 249.6826、44.3812～96.2719、61.0919～ 167.9649mg·g-1.结论 巴戟天中甲基异茜草素和多糖主要分布在根中,水晶兰苷主要分布在叶中.在种植2～6年间,甲基异茜草素和多糖的含量呈先上后降的变化趋势,水晶兰苷的含量则不断积累.     

巴戟天不同炮制品的高效薄层色谱指纹图谱研究

目的以巴戟天药材生品为基础,建立巴戟天不同炮制品的高效薄层色谱(HPTLC)指纹图谱,并比较分析生品的指纹图谱。方法硅胶GF254高效预制薄层板,乙酸乙酯部位以石油醚-乙酸乙酯(5∶5.5)为展开剂,上行展开8 cm,10%硫酸乙醇溶液显色;正丁醇部位以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)上层溶液为展开剂,上行展开8 cm,α-萘酚浓硫酸试剂显色。显色后置紫外光灯365 nm或自然光下检视,得薄层色谱指纹图谱,并进行相关分析。结果巴戟天生品的薄层荧光色谱指纹图谱与巴戟肉(蒸制)、盐巴戟天、制巴戟天(甘草制)图谱比较分析,彼此具有明显的区别,可用于生品与巴戟天炮制品的鉴别。结论通过HPTLC指纹图谱考察,生品巴戟天与巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天的区别较大,应分别制定质量评价的标准。     

广藿香ITS基因型与地理分布的相关性分析

探讨广藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth.的地理分布与ITS基因型的关系，为广藿香的道地性分析和种质评价提供分子依据。采用PCR直接测序技术对不同产地的广藿香ITS₁和ITS₂基因进行测序分析。结果显示，不同产地广藿香ITS₁基因和ITS₂基因核苷酸序列长度分别为424 bp和380 bp，其中前者存在19个变异位点，后者存在5个变异位点，说明广藿香的地理分布和其ITS₁，ITS₂基因型具有良好的相关性，因而ITS₁和ITS₂测序分析可为广藿香的地理分布与基因型的相关性及其种质评价提供有用的分子信息。     

Phylogenetic analysis by RFLP and sequencing of mitochondrial DNA in a Korean population

Analysis of molecular nature of mitochondrial DNA (mtDNA) could be powerful marker for anthropological studies of modern populations. While population genetic studies on mtDNA have been reported for several ethnic groups, no such study has been documented for the Korean population. We surveyed mtDNA polymorphisms in the HVS I of noncoding D-loop region and its upstream region from 430 unrelated healthy Korean population by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and direct sequencing analysis. PCR product with 2,790 bp spanning the specific mtDNA region (mt13715-16504) was subjected to RFLP analysis using 6 restriction enzyme (Hinf I, Hae III, Alu I, Dde I, Mbo I, Rsa I). On the PAUP analysis of PCR-RFLP results, 38 mtDNA haplotypes (Hap 1-38) were detected in the Korean populations, which were classified into 11 haplogroups (Grp 1-11) of related haplotypes encompassing all 38 haplotypes. In comparison of sequencing data with Anderson's reference sequence, the transition type was more prevalent than the transversion type. Insertions or deletions were not found. In addition, three of the polymorphic sites (A16240C, A16351G, G16384A) in HVS-I region are determined newly. The polymorphic sites were distributed randomly in the region, though the frequency at each site was variable. Thus, this research might be required for the genealogical study of Orientals.     

巴戟天中水晶兰苷的提取分离及其含量测定

目的提取分离巴戟天茎中的水晶兰苷并测定巴戟天不同部位中水晶兰苷含量。方法巴戟天茎用80％的乙醇提取，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇萃取物上D101大孔树脂富集环烯醚萜类成分，反复常压正相及反相柱层析，分离得水晶兰苷。采用高效液相色谱法测定巴戟天茎、根、叶中水晶兰苷含量。结果从巴戟天茎中分离得到水晶兰苷。水晶兰苷在巴戟天茎、根、叶的含量分别为18．11、12．22及11．03mg·g^-1。结论巴戟天茎中可以分离得到水晶兰苷，含量比巴戟天根和叶高。