重叠PCR克隆Exendin-4的基因及序列分析

目的克隆Exendin-4 39肽氨基酸序列基因编码区cDNA。方法根据Exendin-4氨基酸序列编码cDNA,设计正、负向引物/模板链,利用重叠延伸PCR法扩增出Exendin-4编码区基因DNA片段;将获得的基因片段插入pGEM-T-Easy质粒中;转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,利用限制性内切酶及核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果经质粒DNA酶切分析及序列测定,获得了Exendin-4 DNA片段序列。结论本研究成功克隆了Exendin-4 cDNA,为下一步构建Exendin-4真核表达载体打下基础,也为Exendin-4基因治疗糖尿病提供了前提条件。     

Exendin-4治疗2型糖尿病的研究进展

 近年来,Exendin-4成为2型糖尿病治疗研究的热点。它是一种含有39肽的氨基酸,与胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide 1,GLP-1）具有相似的降糖机制,属于GLP-1受体激动剂。Exendin-4在血糖浓度较高的情况下能促进胰岛素分泌,不但可以使初治2型糖尿病患者血糖正常,而且对于使用磺酰脲类和双胍类药物治疗失效者也有降血糖作用。本文就Exendin-4的国内外研究进展、作用机制以及临床药效学性质和安全性评价做一综述。     

Exendin-4对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

目的:探讨Exendin-4对人肝癌细胞HepG2增殖的影响。方法:给予不同浓度(0.1、1.0、10.0、100.0nmol/L)的Exendin-4刺激HepG2,使用cell counting kit-8(CCK-8)试剂检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期分布。结果:Exendin-4在0.1、1.0nmol/L水平对人肝癌细胞HepG2无明显促进增殖作用,在10.0、100.0nmol/L水平有明显促进增殖作用,差异具有统计学意义(P<0.05),呈现出浓度、时间依赖性地促进HepG2的增殖,并且随着Exendin-4水平的增加,HepG2G0/G1期细胞比例逐渐下降(P<0.05),S期及G2/M期细胞比例逐渐上升(P<0.05)。结论:Exendin-4在低浓度时对人肝癌细胞HepG2无明显促进增殖作用,但浓度增加到一定水平时具有促进增殖作用,且呈现时间依赖性促进H epG2的增殖效应。     

Exendin-4对STZ糖尿病大鼠胰岛细胞IRS-2表达的影响

目的观察Exendin-4对链脲佐菌素（STZ）糖尿病大鼠空腹血糖（FBG）、胰岛素、胰岛β细胞增殖率和胰岛素受体底物2（IRS-2）表达的影响。方法SD大鼠高糖高脂饲料喂养结合腹腔注射小剂量STZ（35mg／kg）制备STZ糖尿病大鼠模型,随机分成糖尿病组及Exendin-4治疗低、中、高剂量组,并设立正常对照组。Ex—endin-4给药6周后处死大鼠,心脏取血测FBG、糖化血红蛋白（HbA1c）、胰岛素,取胰腺组织切片作苏木精-伊红染色和胰岛素、IRS-2、增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组化染色,计算稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA—IR）及胰岛β细胞增殖率。结果Exendin-4各治疗组IRS-2及β细胞的增殖率较糖尿病组增加（P〈0．05）;Exendin-4高剂量组与糖尿病组比较,FBG和HbA1c水平明显降低（P〈0．01）,HOMA—IR指数改善。结论Exendin-4能够促进糖尿病大鼠胰岛β细胞增殖,改善血糖代谢和胰岛素抵抗,其机制可能与IRS-2表达上调有关。     

CYP3A4和CYP286药物诱导剂体外筛选体系的建立

目的构建CYP酶药物诱导剂的体外筛选技术平台。方法利用双荧光素酶报告基因系统，将包含hPXR蛋白识别和结合调控元件的CYP3A4和286启动子序列插入报告基因上游，将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞，用含有利福平或DMSO培养基培养48h后裂解进行双荧光素酶活性检测。结果经利福平处理的细胞裂解物荧光素酶比活性值与阴性对照组和溶剂组差异显著。结论本研究构建的CYP3A4和286体外筛选平台，可以有效地用于体外诱导剂的筛选。     

CYP3A4和CYP2B6药物诱导剂体外筛选体系的建立

目的构建CYP酶药物诱导剂的体外筛选技术平台。方法利用双荧光素酶报告基因系统,将包含hPXR蛋白识别和结合调控元件的CYP3A4和2B6启动子序列插入报告基因上游,将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞,用含有利福平或DMSO培养基培养48h后裂解进行双荧光素酶活性检测。结果经利福平处理的细胞裂解物荧光素酶比活性值与阴性对照组和溶剂组差异显著。结论本研究构建的CYP3A4和2B6体外筛选平台,可以有效地用于体外诱导剂的筛选。     

神经营养素4前导序列介导Exendin-4表达质粒的构建及鉴定

目的：构建神经营养素4前导序列介导的可分泌表达Exendin-4的重组腺伴病毒载体,为探究Exendin-4用于2型糖尿病临床治疗提供实验基础。方法：使用互补引物/模板法及Ｔ载体克隆法扩增Exendin-4的cDNA克隆,连接于NT4前导肽序列的3′端,融合基因NT4- Exendin-4亚克隆于穿梭质粒pSSHG,转染HEK-293细胞,包装病毒,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果：经酶切、测序证实克隆出Exendin-4 cDNA,成功构建同一开放读码框ORF的NT4前导肽-Exendin-4cDNA克隆,得到高滴度（2.5×10⁹ pfu·L^-1） 的重组腺相关病毒。结论：通过分子克隆技术成功制备了Exendin-4的重组腺伴病毒载体pSSHG /NT4- Exendin-4并成功包装了较高浓度的重组病毒,为进一步研究Exendin-4功能及应用于临床打下基础。     

Exendin-4对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠的干预效果及作用机制研究

目的 研究Exendin-4对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠的干预效果及可能的作用机制.方法 选取无特定病原体级60只SD健康大鼠,将45只大鼠建立糖尿病肾病大鼠模型并随机分为模型组、贝那普利组、Exendin-4低、中和高剂量组,空白组为健康大鼠,每组各9只.建模成功后,贝那普...     

双链腺相关病毒介导表达Exendin-4治疗糖尿病大鼠的研究

目的 构建、鉴定自身互补双链DNA的腺相关病毒(scAAV)重组载体,使其分泌表达Exendin-4,检测其转导效率并观察在糖尿病大鼠模型中的治疗作用.方法 应用基因工程方法改建穿梭质粒pSSHG-CMV,插入外源性基因Exendin-4,构建重组scAAV载体,感染HEK293细胞,ELISA检测转染NIH3T3细胞上清Exendin-4滴度,链佐霉素诱导20只6周龄体质量180 ～220 g SD成年雄性大鼠为糖尿病鼠模型,逆向注射重组scAAV于糖尿病大鼠颌下腺,检测其血糖及胰岛素分泌水平.结果 重组scpSSHG/exn4可有效包装和复制,病毒滴度为2.5×1011 pfu/mL,转染细胞上清分泌Exendin-4浓度可达到4.53 ng/mL,scAAV治疗组血糖浓度在2、4周及8周均低于对照组[分别为(639.17±27.89) vs(396.00±34.00),(657.02 ±39.87) vs (315.62±42.56),(215.6±24.7) vs (458.6±19.7) mg/dL],胰岛素浓度均高于对照组[分别为(156.8 ±24.5)vs(535.9±35.6),(236.5±12.3) vs (495.3 ±18.6),(620.43 ±46.90) vs (381.56±21.78) pg/mL],二者比较有显著统计学差异(P＜0.05).结论 成功构建重组双链腺伴病毒scAAV-Ex-4,具有高效转导能力,对糖尿病大鼠模型具有控制血糖及增加胰岛素分泌作用.     

基于荧光素酶报告基因的MCF7细胞雌激素样物质检测方法的建立

目的:建立基于报告基因的MCF7细胞体外雌激素样物质检测方法,并研究2,2-双(对氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷(2,4-DDT)和甲氧氯(METH)的雌激素样作用.方法:合成人雌激素反应元件(ERE)核心片段并将其插入pGL3-promoter载体的多克隆位点,构建成雌激素反应元件ERE调控的报告质粒pERE-Luc,用脂质体转染法将pERE-Luc及内对照质粒phRL-SV40瞬时转染MCF7细胞,用17β-雌二醇(E2)及受体拮抗剂三苯氧胺(TAM)等处理后检测报告基因荧光素酶的表达,并用雌激素样物质2,4-DDT和METH对方法的有效性进行验证.结果:构建了ERE调控的报告质粒pERE-Luc,转染pERE-Luc的MCF7细胞报告基因的表达与E2呈明显的剂量反应关系,1×10-11mol/L E2可引起报告基因表达,至1×10-9mol/L可达到最大表达值,而未转染pERE-Luc时与E2无明显反应,TAM可以显著抑制E2引起的报告基因的表达.验证结果表明,2,4-DDT浓度>1×10-7mol/L及METH浓度>1×10-6mol/L时可产生雌激素样活性,2,4-DDT的雌激素样活性强于METH.结论:建立的基于荧光素酶报告基因的体外雌激素样物质检测方法有效可靠,以此方法检测2,4-DDT和METH显示有明显的雌激素样活性作用.     

人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的建立

目的建立靶向人高密度脂蛋白受体基因(CLA-1)调控序列的药物筛选模型,为筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂奠定基础.方法PCR扩增CLA-1上游调控序列,构建重组报告基因质粒pGL3-CLAP,瞬时转染人肝癌细胞BEL-7402,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂.结果建立了CLA-1表达上调剂筛选模型,pGL3-CLAP与阴性对照pGL3-Basic组间差异显著(P＜0.001),变异系数(CV)不超过10%.对124个化合物和800个微生物次级代谢产物进行初筛和复筛,1个化合物和3个菌株发酵液为阳性.结论该系统可有效地应用于人高密度脂蛋白受体表达上调剂的高通量筛选.     

孕烷X受体应答元件萤光素酶报告基因的构建及活性检测

目的建立孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)应答元件萤光素酶报告基因,并检测其活性。方法利用化学合成方法得到五聚体PXR应答元件(everted repeat elelment-6,ER-6元件)5和(direct repeat element-3,DR-3)5序列;将五聚体PXR应答元件序列(ER6或DR3)克隆至p GL3-Promoter载体上;利用萤光素酶报告基因系统检测PXR应答元件报告基因的活性。结果 PXR应答元件萤光素酶报告基因具有明确的活性。PXR激动剂茴香霉素能够剂量依赖地诱导ER6-Luc(R2=0.95;P=0.002 2)和DR3-Luc(R2=0.96;P=0.000 91)报告基因的活性,其EC50值分别为(0.11±0.04)μmol/L和(0.13±0.06)μmol/L;PXR拮抗剂酮康唑能够剂量依赖地降低茴香霉素诱导的ER6-Luc(R2=0.97;P=0.000 85)和DR3-Luc(R2=0.98;P=0.000 11)的活性,IC50值分别为(0.71±0.11)μmol/L和(1.73±0.15)μmol/L。结论成功构建了PXR应答元件报告基因,建立了PXR转录活性的检测方法。     

颌下腺注射分泌表达Exendin-4的重组腺相关病毒治疗糖尿病大鼠

目的：探讨颌下腺(submandibular gland,SG)重组双链腺相关病毒(double-stranded adeno-associated virus,dsAAV)表达Exendin-4治疗2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠模型的机制。方法：对T2DM大鼠SG注射重组Exendin-4/dsAAV,于第2,4及8周采用实时荧光定量检测胰岛素及α-淀粉酶表达,第8周行SG组织内胰岛素含量分析,胰腺切除后检测血糖及胰岛素水平,采用免疫组织化学方法检测 Exendin-4和胰岛素的表达。结果：重组dsAAV治疗组可观察到SG腺体明显增大,胰岛素基因表达增加,α-淀粉酶变化不显著,免疫组织化学检测Exendin-4及胰岛素阳性;重组dsAAV治疗组胰腺切除后血糖较对照组低,胰岛素分泌增加(P<0.05)。结论：重组dsAAV/Exendin-4不仅可以在SG细胞持续表达Exendin-4,而且可能诱导胰岛素表达从而降低血糖水平,同时不影响SG功能。     

GLP-1(7-36)及其拟似物Exendin-4阻断高血糖诱导的胰腺血流重分布

 目的 测定GLP-1和Exendin-4对大鼠胰岛微循环的影响。方法 大鼠随机分为生理盐水组（NS）和葡萄糖组（GLU）;每组再分为3个亚组,分别为对照组、GLP-1组和Exendin-4组。采用微球技术测定大鼠胰腺血流（pancreatic blood flow, PBF）和胰岛血流(islet blood flow, IBF）。用ELISA法测定血清胰岛素。结果 GLP-1和Exendin-4不影响基础胰岛微循环,但降低糖负荷后IBF/PBF比值 (GLP-1组为11.47%±1.11% vs 14.33%±0.53%;Exendin-4组为11.25%±1.26% vs 14.33%±0.53%, P<0.05),阻断高血糖诱导的胰腺血流向胰岛内重分布。GLP-1对基础和糖负荷后血糖无影响,Exendin-4 显著降低基础血糖(4.1±0.23 mmol/L vs 5.4±0.37 mmol/L,P<0.05)和糖负荷后血糖(17.9±0.97 mmol/L vs 22.0±0.69 mmol/L, P<0.05)。结论 GLP-1和其长效拟似物Exendin-4能有效调节糖负荷后的胰岛微循环。     

NFAT5基因报告载体的构建及其与miR-155关系的实验研究

目的 通过生物信息软件预测出miR-155的靶基因,构建miR-155靶基因荧光素酶基因报告载体,验证其与miR-155的对应关系.方法 以数据库miR Base为依据,对miR-155进行生物信息学分析,通过Target Scan、Mir Base、Pic Tar三大软件预测miR-155的靶基因;将设计合成的T淋巴细胞核因子5(NFAT5)及其突变序列NFAT5-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒pMIR-REPORTTM Luciferace;将第4代人胚胎肾293AD(HEK-293AD)细胞按随机数字表法分为4组:miR-155 mimics+pMIR-NFAT5组、miR-155 mimics+pMIR-NFAT5-mu组、miR-155 inhibitor+pMIR-NFAT5组、miR155 Negative control+pMIR-NFAT5组与对照质粒(pRL-TK)共转染24 h后用双荧光素酶检测试剂盒测定相对荧光素酶活性.结果 Mirbase、TargetScan、PicTar预测交叉结果显示,NFAT5基因3'UTR与miR-155存在结合互补位点;构建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu重组质粒经酶切及测序鉴定正确;双荧光素酶报告基因检测系统显示:pMIR-NFAT5+ miR155 mimics组较pMIR-NFAT5+miR-control组荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(P＜0.01);而其他组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu荧光素醇报告基因重组质粒;证实miR-155对NFAT5基因mRNA 3'-UTR具有靶向调控作用,为下一步研究miR-155在吸入性肺损伤机制中的作用提供前期实验室数据和方法.     

聚乙二醇化重组人改构白细胞介素11在食蟹猴体内药代动力学检测方法的建立

目的 通过建立聚乙二醇(PEG)抗体结合ELISA法检测PEG化重组人改构白细胞介素11(PEG-mIL11)的血药浓度,PEG-mIL11在食蟹猴体内的药代动力学特征、血药浓度与量效关系.方法 食蟹猴皮下注射PEG-mIL11后,在不同时间点采集血样,采用PEG抗体结合ELISA法(双抗体夹心免疫法)测定血清中的PEG-mIL11浓度,计算药代动力学参数,并检测不同时间点的血小板计数,探索血药浓度与量效关系.结果 方法特异性良好,准确度与精密度均满足要求,线性范围26.34 ～ 200 ng/ml,可用于样品检测.PEG-mIL11在食蟹猴体内的消除T1/2为(13.4±2.4)h,Tmax为(6.7±2.3)h,Cmax为(2.4±0.5) μg/ml,AUC(01)值为(77.7±15.6) μg·h/ml,CL为(4.6±0.8)ml／(h·kg);而且PEG-mIL11血药浓度达峰先于药效达峰,药效明显滞后.结论 PEG抗体结合ELISA法测定PEG-mIL1 1浓度,方法稳定可靠,可满足药代动力学研究的需要.PEG修饰mIL-11达到了延长其体内代谢的效果,可减少给药次数,提高治疗便利性.     

大豆黄素衍生物的合成及其与雌激素受体亲和力的研究

目的:以大豆黄素为先导物,设计并合成其衍生物,检测它们与雌激素受体的相对亲和力。方法:以间苯二酚为原料,经多步反应合成目标化合物,并进行与ERα和ERβ的结合竞争抑制实验。结果和结论:合成了8个新化合物(6a~6d,7a~7d)并经波谱测试确证其结构;4个化合物(6a,6b,7a,7b)与ERα的亲和力优于大豆黄素,5个化合物(6a,6b,7a,7b,7c)与ERβ的亲和力优于大豆黄素。7-羟基衍生物与ERα和ERβ的亲和力优于相应的7-甲氧基衍生物。化合物7a对ERβ的IC50值为2.26 nmol/L,对ERβ的选择性亲和力优于大豆黄素和雷洛昔芬。