石蜡包埋组织中DNA甲基化特异性PCR技术

目的 以石蜡包埋组织提取的DNA为模板进行DNA甲基化特异性PCR(MSP)检测,研究其可行性.方法 35例石蜡包埋肺癌组织DNA样品制备和亚硫酸氢盐修饰后进行MSP扩增检测.结果 石蜡包埋组织MSP检出率与文献采用新鲜组织标本报道一致.结论 MSP通过选择合适的实验条件,可适用于石蜡包埋组织DNA甲基化分析.     

石蜡包埋组织的p16基因甲基化特异性PCR技术

目的以石蜡包埋组织为材料进行DNA甲基化特异性PCR(MSP)检测,研究其可行性.方法40例食管组织以中性福尔马林固定、包埋、脱蜡、DNA样品制备和亚硫酸盐修饰后进行PCR测定.2例MSP阳性的冰冻甲状腺组织以70%酒精、丙酮和中性福尔马林分别固定及石蜡包埋后,非甲基化引物PCR扩增,比较不同固定剂的MSP效果.结果石蜡包埋食管组织MSP检出率与文献报道的冰冻组织MSP检出率相同,三种常用方法固定的甲状腺组织均能获得理想的MSP效果.结论MSP通过选择合适的实验条件,可应用于石蜡包埋组织.     

石蜡包埋组织的p16基因甲基化特异性PCR技术

目的：以石蜡包埋组织为材料进行DNA甲基化特异性PCR(MSP)检测，研究其可行性。方法：40例食管组织以中性福尔马林固定、包埋、脱蜡、DNA样品制备和亚硫酸盐修饰后进行PCR测定。2例MSP阳性的冰冻甲状腺组织以70％酒精、丙酮和中性福尔马林分别固定及石蜡包埋后，非甲基化引物PCR扩增，比较不同固定剂的MSP效果。结果l石蜡包埋食管组织MSP检出率与文献报道的冰冻组织MSP检出率相同，三种常用方法固定的甲状腺组织均能获得理想的MSP效果。结论：MSP通过选择合适的实验条件，可应用于石蜡包埋组织。     

缺陷DNA错配修复与复发性子宫内膜癌的关系

目的:研究缺陷DNA错配修复(MMR)是否与散发的子宫内膜癌患者高复发风险相关。方法:收集44例子宫内膜癌患者原发肿瘤病灶组织复发后(分期为Ⅰ期)肿瘤病灶组织及对照组相匹配的44例子宫内膜癌无复发患者(术后随访3年以上)原发肿瘤病灶组织。石蜡包埋原发性肿瘤组织(n=88)及复发后肿瘤组织(n=32),采用免疫组织化学方法分析hMSH2及hMLH1的表达。根据染色强度及数量计算染色指数(SI0～9)。从石蜡包埋组织中提取DNA,采用巢式甲基化-特异性PCR方法(MSP-PCR)检测hMLH1甲基化启动子。采用BAT-26或BAT-25分析其微卫星不稳定性(MSI)。…     

巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化

目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-1基因启动子的异常甲基化状态。方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-1基因启动子的异常甲基化。结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析。     

浅谈从石蜡包埋组织中提取DNA的方法及体会

用于聚合酶链式反应(PCR)扩增的从石蜡包埋组织中提取DNA的方法在理论上非常简单,但在实际操作中并非如此.必须先溶解组织切片中的石蜡,然后处理组织释放DNA.在实验过程中每一步骤都必须严格要求,否则提取的DNA就不理想,影响下一步实验.本文就从石蜡包埋组织中提取 DNA 的方法谈一些体会.     

一步法分离石蜡切片DNA的改进与鉴定

目的　改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法　石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55　℃消化3　h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果　以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论　改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。     

BLU和ARF基因在鼻NK/T细胞淋巴瘤中的甲基化状态比较

目的:检测BLU与ARF基因启动子在鼻NK/T细胞淋巴瘤中的甲基化状态,探讨其在肿瘤发生中的作用与分子病理诊断中的应用价值. 方法:选用12例已经确诊的鼻NK/T细胞淋巴瘤的冰冻组织标本和35例石蜡组织标本. 将提取的DNA经亚硫酸盐处理后,用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)方法检测BLU和ARF基因启动子的甲基化状态. 结果:在12例鼻NK/T细胞淋巴瘤冰冻组织病例中,12例均有BLU基因高度甲基化,仅1例有ARF基因高度甲基化;35例石蜡组织病例中,BLU基因高度甲基化8例,ARF基因高度甲基化3例. BLU基因高度甲基化阳性率明显高于ARF基因. 结论:BLU基因高度甲基化可能在鼻NK/T细胞淋巴瘤发生发展有重要作用,基因甲基化检测可作为分子标记物用于临床病理诊断.     

白芷ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的:建立白芷的ISSR最佳反应体系及PCR扩增参数,为今后利用ISSR标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序.方法:以白芷基因组DNA为模板,分析了ISSR反应体系中模板DNA、Mg2 、dNTPs、引物浓度,TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响.结果:建立了重复性好,分辨率高的ISSR反应体系,即在25μL反应体系中,模板DNA浓度为10～30 ng,2.5μ10×PCR buffer(Mg2 free),MgCl2 2.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.6 pμmol/L;扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,引物在筛选后的最佳退火温度退火45 s,72℃延伸2min,共计39个循环,循环结束后在72℃延伸5 min.结论:建立了适用于白芷的ISSR反应体系.为今后利用ISSR标记技术开展白芷遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础.     

两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化

【目的】建立适合两面针简单重复序列—聚合酶链反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序。【方法】采用改良的高盐低pH法提取两面针基因组DNA,通过单因素试验和正交试验相结合对ISSR反应体系中的主要成分(Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板)进行筛选和优化,并考察退火温度对扩增结果的影响。【结果】最佳的PCR反应体系为:总体积为25μL,含1.50 mmol/L Mg2+、150μmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶、0.60μmol/L引物、2.40 ng/μL DNA模板。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,51.4℃退火45 s,72℃延伸2 min;35个循环;72℃再延伸10 min。【结论】优化了两面针ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为两面针ISSR遗传多样性分析打下基础。