肠道病毒71型感染研究进展

肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）属于小RNA病毒科（Picomaradae）肠道病毒属（Enterovirus）,同一属的病毒还有脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒等。这类病毒通过在人体的消化道组织中侵袭与繁殖,后经过血液循环传播,而最终导致多种临床病征。EV71最初于1969年由Schmidt等从美国加利福尼亚州1名9个月大的脑炎患儿的脑脊液中分离出,1972年定出血清型,并于1974年首次报道。其后,在全世界发现各种各样的临床表现和很多致命性感染与EV71相关。     

肠道病毒71型分子生物学研究

就有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。     

大连市肠道病毒71型基因特征分析

目的 了解大连市手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的VP1区段的基因特征.方法 用RT-PCR方法从手足口病患者临床标本中扩增EV71的VP1基因全序列,利用软件进行同源性分析和构建系统发生树.结果 测序获得的9株病毒基因与C4亚型代表株具有较高的核苷酸和氨基酸序列同源性.在系统进化树上,9株病毒基因与C4基因亚型代表株处于同一分支.结论 大连市EV71病毒株属C4亚型.     

人肠道病毒71型亚单位疫苗的研制

目的利用原核表达技术制备人肠道病毒71型(EV71)的亚单位融合疫苗,并通过小鼠模型对其保护效果进行评价。方法在大肠杆菌中融合表达EV71的亚单位肽段,随后将肽段免疫雌鼠,对其交配后产下的幼鼠进行病毒感染,通过检测其组织内的病毒拷贝数和病理变化,对疫苗的保护效果进行评价。结果通过肽段融合的方法,得到五种备选疫苗,分别为VacA,VacB,VacC,VacD和VacE,这五种疫苗均具有一定的体外保护能力,并且VacB和VacC与正常人大脑组织无明显交叉反应。动物模型评价结果显示,VacB和VacE能赋予幼鼠抗病毒感染的保护效果。结论利用EV71的小鼠感染模型评价了针对EV71的亚单位联合疫苗,VacB和VacE的保护效果较好,此外,VacB与人脑组织间无明显交叉反应,可以作为潜在的无神经毒性的临床使用疫苗。     

1株肠道病毒71型毒株的分离与鉴定

目的 探讨手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的分离与鉴定方法。方法 采集手足口病疑似病例的咽拭子标本1份接种于人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell, RD细胞),通过观察病毒的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)来分析EV71的分离效果。分别利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹分析(Western Blotting)方法来鉴定EV71病毒特异性核酸和蛋白。扩增EV71VP1区全长基因,对其序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 手足口病疑似病例咽拭子标本接种RD细胞传代至第2代后出现CPE。RT-PCR和Western Blotting检测结果均显示,感染组RD细胞中有EV71病毒特异性条带,暂命名为EV71分离株2016SHYP001。序列分析结果显示,2016SHYP001株病毒的VP1区核苷酸与C型代表株的同源性较高,为93.1%~98.3%;其中与C4a亚型代表株的同源性最高,为98.3%。进化树分析发现本地流行株与深圳地区流行株的亲缘较近。结论 成功分离出一株新的EV71病毒株2016SHYP001,其株型为C4a亚型。     

2014-2015年江苏省肠道病毒71型基因特征分析

目的：探讨2014-2015年江苏省肠道病毒71型(EV71)分离株的病毒基因特征。 方法：用RD细胞对EV71核酸检测阳性的标本进行病毒分离。选取35株具有代表性的EV71分离株进行VP1区的序列测定和分析。序列结果用DNA Star和MEGA 6.0软件进行分析,并与各型参考株进行比较。 结果：35株EV71分离株VP1区的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.3% ～100%和96.6% ～100%,与 EV71的C4a亚型代表株安徽阜阳株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.6%～97.9%和在97.9%～100%;在系统进化树上与C4a亚型代表株相聚在一起,并且存在2个进化分支。 结论：2014-2015年江苏省分离的35株EV71毒株均属于C4a亚型;江苏省EV71流行株可能与国内其他省市流行的病毒有着共同的祖先,再各自进化。     

重症手足口病流行病学特点及肠道病毒71型疫苗的研究进展

手足口病主要由肠道病毒引起,是一种好发于儿童的传染性疾病,其传播途径为消化道、呼吸道和密切接触等,尤其以3岁以下年龄组发病率最高。普通手足口病转至重症手足口病时间短,进展快,病情重,预后差,发病率高,对患儿的身体健康和生命安全造成严重威胁。其中,肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型等是手足口病的主要病原体。而EV71为重症手足口病的主要病原体。近年来,重症手足口病在全国范围内仍流行,因此掌握其流行特点显得尤为重要。重症手足口病的关键在于预防,目前国内外已研究出如灭活疫苗、减毒活疫苗等EV71疫苗,但大都在Ⅳ期临床试验。未来应继续研究多价疫苗,以多方位预防手足口病的发生。     

广州地区儿童肠道病毒71型分离与鉴定

目的 调查广州地区2004年度EV71感染的流行病学特征.方法 采集可疑为肠道病毒感染患者粪便、疱疹液、咽拭子和脑脊液标本,进行病毒分离和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)特异性扩增进行鉴定,随机选取其中4株EV71分离毒株,对其VPI区进行核苷酸序列测定,并参考EV71各基因型的参考毒株和以往中国EV71的分离毒株进行同源性分析.结果 全年EV71病毒检出率3.09%(13/421),主要集中在该年度4月份,13株均来自手足口病患者.4株EV71病毒株之间同源性高达97.5%～99.6%;与A、B基凼型代表株比较,同源性在83.2～84.7%,83.4%～84.7%之间,差异大于15.3%;与EV71病毒C基因型代表株比较,同源性在89.3%～95.1%,较为接近,差异小于12%;与国内以往分离到的Il株CA亚型毒株的核苷酸同源性可达91.9%-97.5%.结论 广州地区2004年度EV71感染的检出率较低,以手足口病的方式.未见其它的并发症,基因型属C4亚型,与近年我国大陆地区流行的EV71株在进化上可能属于同一基因.     

质谱法分析肠道病毒71型疫苗原液的主要蛋白成分

目的采用质谱法对我国2家进入临床试验肠道病毒71型（EV71）灭活疫苗的主要蛋白成分进行分析和比较,为完善EV71疫苗的质控方法提供实验依据。方法应用梯度SDS-PAGE法对2家生产自Vero细胞的EV71疫苗原液（A、B原液）进行蛋白电泳分析,蛋白条带经切胶回收、脱色、胰酶酶切后提取蛋白多肽,采用液质联用仪（LC/MS）对回收的各条带蛋白多肽进行二级质谱序列测定。采用酶联免疫法（ELISA）和二喹啉甲酸法（BCA）分别检测浓缩后的疫苗原液中EV71抗原含量和总蛋白含量,计算比活值。结果将原液浓缩10余倍后经梯度SDS-PAGE电泳分析,抗原A为4条带,抗原B为6条带。采用质谱法检测各条带蛋白并搜库分析发现,各条带均含有EV71多聚蛋白;抗原A条带1、3和抗原B的条带1、3、4、5、6含有猴源蛋白。经PSMs（鉴定多肽次数）计算发现EV71蛋白占总蛋白比例分别为96.7%和95.0%,比活值为865.5、291.8U/μg。结论质谱法可作为疫苗中蛋白检测的辅助方法,并考虑在多批次检测的基础上提出限量要求,为疫苗质量的一致性提供保障。     

2014—2015年江苏省肠道病毒71型VP1基因特征分析

目的：探讨2014—2015年江苏省肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)分离株的病毒基因特征。方法：用RD细胞对RT?鄄PCR初筛EV71阳性的标本进行病毒分离,成功分离到的EV71分离株进行VP1区的序列测定和分析。序列分析结果用DNA Star和MEGA 6.0软件进行分析,并与各型参考株进行比较。结果：共分离到35株EV71型毒株,分离阳性率为29.17%。35株EV71分离株VP1区的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.3%～100.0%和96.6%～100.0%,与EV71的C4a亚型代表株安徽阜阳株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.6%～97.9%和97.9%～100.0%;在系统进化树上与C4a亚型代表株相聚在一起,并且存在2个进化分支。结论：2014—2015年江苏省分离的35株EV71毒株均属于C4a亚型;江苏省EV71流行株可能与国内其他省市流行的病毒有着共同的祖先,再各自进化。     

制备肠道病毒71型黏膜疫苗的初步探索

目的利用同源重组技术将肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因重组入枯草芽胞杆菌基因组,进而将VP1蛋白展示在其芽胞表面制备EV71黏膜疫苗。方法将枯草芽胞杆菌CotB基因与VP1基因连接后插入整合质粒pDG1662,得到重组质粒pDG1662-CotB-VP1,电转化法转化枯草芽胞杆菌1A771,抗生素抗性筛选,PCR、Westernblot、免疫荧光鉴定VP1基因重组及蛋白表达情况。结果 VP1基因成功重组入枯草芽胞杆菌基因组中,VP1蛋白在芽胞表面得到了有效表达。结论 EV71衣壳蛋白在枯草芽胞杆菌芽胞表面得到了有效表达,为研究EV71黏膜疫苗奠定基础。     

不同免疫方案制备肠道病毒71型抗血清的免疫效果比较

目的比较不同免疫方案制备肠道病毒71型(EV71)抗血清的免疫效果,选择最佳免疫方案。方法制备EV71,并对病毒进行滴定和灭活。将BALB/c鼠随机分为5组,每组9只。1、2组以灭活病毒免疫,3、4组以活病毒免疫,1、3组的免疫间隔时间为2周,2、4组为3周,第5组为对照组,用磷酸盐缓冲液(PBS)免疫,免疫间隔2周。免疫4次后用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组小鼠血清抗体滴度。结果 4个实验组均产生阳性抗体(A/A0≥2.1),对照组抗体阴性(A/A0<2.1),1～5组吸光度值依次为1.081 7±0.289 7、1.029 6±0.3719、1.074 8±0.374 9、1.492 9±0.215 9、0.168 7±0.021 8。对其进行单因素方差分析,F=23.449,P<0.05,差异有统计学意义,LSD-t检验结果,第4组与1、2、3组差异均有统计学意义(P<0.05),而1、2、3组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论各组抗体滴度不完全相同,其中第4组即活病毒间隔3周免疫组抗体滴度最高,所以活病毒间隔3周免疫方案可作为制得高滴度EV71抗血清的理想选择。     

宁夏2011年肠道病毒71型VP1区域序列分析

目的 分析2011年宁夏肠道病毒71型分离株VP1的遗传特征.方法 对宁夏40株EV71分离株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析.结果 2011年宁夏40株分离株与A、B、C型基因型代表株的核苷酸同源性分别为80.9%～82.7%、81.4%～84.8%、87.2%～93.7%,氨基酸同源性分别为94%～95%、96.6%～98%、97.7%～99.7%,与C4a亚型同源性最高;VP1区遗传进化分析表明,这40株同属于C4a亚型.结论 2011年宁夏流行的肠道病毒71型均为C4a亚型,病毒未产生明显的变异,其流行存在多条传播链.     

肠道病毒71型微复制子的构建

目的 构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系,研究微复制子的复制及表达情况。方法 聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白(EGFP),利用特定酶切位点及连接酶,将目的基因片段连接至pMD19-T载体,分别构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系。荧光显微镜下观察微复制子表达情况,实时荧光定量PCR观察微复制子复制情况。结果 EV71非结构蛋白微复制子及EV71 3C蛋白酶微复制子表达后,均可观察到特异性绿色荧光,荧光强度有明显差异;转染后12~72 h取样所测RNA含量几乎不变。结论 非结构蛋白全长及3C蛋白酶启动微复制子转录强度不同,所构建微复制子不具备复制功能,提示结构蛋白编码区对病毒RNA复制有重要意义。     

吉林省长春市手足口病患者流行病学特征及肠道病毒71型VP1基因特征分析

目的:分析2014-2018年吉林省长春市手足口病流行特征及肠道病毒71型(EV-A71)VP1基因特征,探讨其流行规律,为及时调整防控策略提供参考依据.方法:利用中国疾病预防控制信息系统中的数据,采用描述性流行病学方法对2014-2018年吉林省长春市手足口病疫情数据进行分析.收集2014-2018年吉林省长春市医疗...     

2010年天津市流行的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VPl区域序列分析

【目的】研究2010年天津市手足口病患者中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的VPl基因特征。【方法】采集60例天津地区2010年手足口病流行期间患儿的粪便标本,分别用EV71和CoxAl6的VPl区域引物对粪样中病毒RNA进行PCR检测。同时选取11株EV71扩增阳性和4株CoxAl6扩增阳性的样本,对其扩增产物的VPl区进行核苷酸序列测定,比照EV71和CoxAl6各基因型进行同源性分析,并构建系统发生树。【结果】从60例手足口病患儿粪便标本共检测出27例EV71阳性和4例CoxAl6阳性。经VPl区测序,11例EV71阳性与EV71C4基因型同源性94．4％～94．8％;4例CoxAl6阳性与CoxAl6C基因型同源性93．4％-94．7％。在系统发生树上,这11株EV71均属于EV71C基因型,与c4亚型属于同一分支;4株CoxAl6均属于CoxAl6的C基因型。【结论】2010年天津市手足口病患者粪便样本中检测出的EV71毒株属于EV71C4亚型,CoxAl6毒株属于CoxAl6C基因型。     

利血平治疗重型肠道病毒71型感染导致高血压患儿疗效观察

目的：探讨利血平辅助治疗EV71感染重症患儿所致高血压的疗效。方法：选择我院2010年4～6月均为EV71病毒阳性30例儿科住院患儿。将患儿随机分为对照组和治疗组,均应用甲泼尼龙、静脉注射用人免疫球蛋白、利巴韦林、米力农和其他常规性治疗,其中对照组15例未用利血平,治疗组15例加用利血平。利血平每次剂量0.07 mg/kg,每次最大量〈1.00 mg,血压降至正常后渐减量停用。结果：治疗12 h后,治疗组血压降至（100±10）mm Hg,对照组为（140±13）mm Hg,治疗组降压效果较对照组显著（t=3.71,P〈0.05）。结论：利血平可以辅助治疗EV71感染所致危重患儿病程中所出现的高血压,在降血压的同时可以耗竭患儿体内的儿茶酚胺,可以降低死亡率。     

传统头颅MR序列阳性与阴性的重症EV71感染临床特征的差异

目的：比较传统MRI阳性EV71脑炎与MRI阴性脑炎患者临床特征。方法选取21位传统MRI阴性的EV71患儿与11位MRI阳性的EV71脑炎患儿,所有患儿进行传统的MRI检查（T1WI、T2WI、FLAIR）,并根据检查结果将患儿分为MRI阳性组及MRI阴性组,比较两组临床特征。结果 MRI阴性组的临床特征,包括年龄、性别、高热、皮疹、肢体震颤、头痛、呕吐、心率加快、呼吸加快、高血压、意识障碍、肢体无力、眼球运动异常、肺出血、血糖、血白细胞计数、CSF压力、CSF细胞数、CSF总蛋白与MRI阳性组比较,无统计学差异。结论传统MRI阳性的EV71脑炎患儿,并不代表其临床特征更差。为了识别更加严重的EV71脑炎,可能需要行增强MRI或弥散-加权成像的MRI。