HDAC2基因RNA干扰载体的构建

目的:构建组蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)基因RNA慢病毒干扰质粒载体.方法:对比HDAC2基因序列,设计并合成短发夹RNA(shRNA)干扰靶点序列,克隆入经AgeI与EcoRI双酶切后的RNA干扰载体pLKO.1-puro,构建pLKO.1-HDAC2-shRNA重组质粒,采用酶切法和测序法验证重组质粒.结果:成功退火合成3对短发夹RNA序列并将其克隆入pLKO.1-puro载体中,构建重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA1、pLKO.1-HDAC2-shRNA2及pLKO.1-HDAC2-shRNA3,经酶切鉴定和测序验证重组质粒载体与预期靶序列相同.结论:成功构建HDAC2-shRNA慢病毒干扰载体,为进一步研究HDAC2的功能及应用提供有效工具.     

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.     

RNA干扰Neuropilins-2基因真核表达载体的构建及其鉴定

目的 构建Neuropilins-2(NRP2)基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体.方法 以NRP2为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构件重组体,根据GenBank数据库提供的NRP2基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.重组pGenSil-NRP2载体转染LOVO细胞48 h,收获细胞,采用Western blotting检测其NRP2蛋白表达.结果 经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功.重组体pGenSil-NRP2转染LOVO细胞48 h后NRP2蛋白表达显著降低.结论 利用RNAi技术可成功构建抑制NRP2表达的小干扰RNA重组体.     

大鼠血管内皮生长因子shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制角膜新生血管的研究做准备.方法:用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pSihncer2.0 U6中,进行酶切鉴定和测序.结果:酶切证明构建的shRNA序列已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠VEGF shRNA表达质粒.结论:成功构建了3条大鼠VEGF shRNA真核表达质粒,为靶向VEGF的RNAi抑制角膜新生血管奠定了基础.     

CD146短发夹RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 CD146基因表达增高与涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)的临床症状相关.为进一步研究CD146基因的功能,构建人CD146短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并鉴定.方法 根据Genebank中靶基因CD146序列,按照Tuschl设计原则,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pGenesil-1载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定.结果 经过限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定,证实重组质粒pGe-CD146-shRNA的序列正确.结论 成功构建了靶向人CD146基因的shRNA真核表达载体系统,为进一步研究CD146基因的功能奠定了实验基础.     

Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向Survivin基因及CDKl基因的短发夹样RNA（Short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体。方法根据Genbank报道的Survivin序列及CDKl序列,遵循shRNA设计原则设计并合成各自靶向的Survivin、CDKl基因的shRNA寡核苷酸序列,构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒,并进行限制性内切酶酶切及基因测序鉴定。结果经酶切及测序结果分析,pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shR-NA-Survivin-U6-shRNA—CDK1双基因系列串联重组质粒均成功构建。结论成功构建Survivin基因及CDKl基因联合靶向shRNA重组质粒,为进一步研究Survivin基因和CDKl基因联合干扰提供了新的方法。     

STAT3基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术,以信号转导和转录激活因子3(STAT3)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析鉴定。方法设计一条有小发夹结构的DNA序列,聚合酶链反应(PCR)扩增合成siRNA表达框架(SECs)表达框架,克隆至载体psi Lent GeneTM中构建重组体,转化E.coli DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后测序分析。结果重组质粒经EcoRⅤ酶切、电泳、测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。结论成功构建了STAT3靶向RNA干扰重组体,为肿瘤的基因治疗在分子水平、细胞水平和整体水平的研究提供一些新方法。     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒,为进一步探究RNA干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的RNA干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的RNA引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shRNA]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shRNA]-EGFP-CaSR,转化至感受态E.coli DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shRNA引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒。     

人组织因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的:利用RNA干扰(RNAi技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建特异性的RNA干扰真核细胞表达载体.方法:根据GenBank提供的人TF基因的核苷酸序列,设计具有小发夹结构的2条DNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至干扰载体pSUPER质粒中,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,最后进行DNA测序.结果:构建成功的针对人TF基因的RNA干扰真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计序列完全一致.结论:成功构建了针对人TF基因的真核载体,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新方法.     

EBV-LMP1基因杆状病毒表达载体的构建及其在昆虫细胞中的表达

目的：构建EBV-LMP1基因的杆状病毒重组供体质粒，包装重组LMP1的杆状病毒，感染昆虫细胞进行表达。方法：先将已克隆的LMP1 cDNA与线性化的pFastBACHTb进行连接，使pFASTBACHTb-LMP1与DHl0BAC感受菌进行转座重组，利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid／LMPl克隆，提取Bacmid／LMP1转染昆虫细胞Sf9包装杆状病毒，利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达，通过免疫荧光、SDS-PAGE和Western-blot检测表达情况。结果:获得了重组LMP1的杆状病毒，细胞能表达出与LMP1单抗结合的蛋白，分子量为63kDa左右，细胞可直接分泌LMP1蛋白至上清。结论:LMPl能在昆虫细胞中获得良好表达，为研究肿瘤疫苗及LMPl在EBV致瘤分子机理中的作用奠定了基础。     

利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBVC基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual—HBV core，转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9，获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBVC基因的重组杆状病毒，而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白，为进一步研究奠定了基础。     

Fas、Fas—L和Bcl—2蛋白在胃癌的表达及其意义

目的：研究凋亡相关蛋白Fas、Fas-L和Bcl-2在胃癌中的表达及其意义。方法：应用免疫组化S－P法对10例正常胃粘膜、66例胃癌及28例癌旁组织进行检测。结果：①Fas、Fas-L和Bcl-2在胃癌中表达的阳性率分别为57.58％、50.00％和51.51％;在癌旁为80.14％、53.33％和28.57％;在正常胃粘膜中为100％、0％和0％;②Fas表达在I、II期组织明显高于III、IV期组,在无淋巴结转移组明显高于有淋巴结转移 组;③Fas-L和Bcl-2在肠型胃癌中的表达明显高于弥漫型胃癌;④肿瘤周围浸润的淋巴细胞有明显的Fas及Fas-L表达。结论：Fas的下调表达及Fas-L的上调表达在胃癌的发生发展中起重要作用,Fas-L和Bcl-2在肠型胃癌的发病机制中发挥重要的作用,Fas的表达对估计病人的预后 有一定的价值。     

人脂联素球状结构域基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的 利用杆状病毒表达系统表达人脂联素球状结构域(gAd)基因.方法 以人基因组为模板,PCR法扩增人gAd基因,将gAd基因与供体质粒pFastBacHTB连接,转化含有穿梭载体:Bacmid的大肠杆菌DH10Bac.筛选转座成功的重组穿梭载体Bacmid-gAd,通过脂质体介导,转染昆虫细胞Sf9,经SDS-PAGE、免疫印迹法检测表达产物.结果 重组杆状病毒感染的Sf9细胞形态变化明显,SDS-PAGE电泳结果 显示,Bacmid-gAd组和对照组相比,在相对分子质量15 000～25 000之间多出一清晰的蛋白条带,免疫印迹法证实该条带能与相应的抗His标签抗体结合.结论 人gAd基因成功在真核细胞中表达,为后续的实验研究奠定了基础.     

实验性病毒性心肌炎心肌MHCⅡ类抗原的表达

[目的]研究病毒性心肌炎(VMC)心肌组织相容性抗原Ⅱ类(MHCⅡ类抗原)的表达特点,探索轻度、不典型VMC的法医病理学诊断方法.[方法]以1035TCID50的CoxsackieB3病毒接种Balb/c小鼠,诱导小鼠轻度VMC.用免疫组化技术检测VMC小鼠心肌MHCⅡ类抗原的表达.[结果]VMC小鼠心肌组织内MHCⅡ类抗原异常表达,部分心肌细胞膜局灶性MHCⅡ类抗原阳性.[结论]心肌MHCⅡ类抗原的异常表达参与了轻度VMC的发病机制;心肌MHCⅡ类抗原-LSAB染色可望成为诊断轻度、不典型VMC的免疫病理学指标.     

实验性大鼠腮腺细胞缺血再灌注TGF—β1的表达

目的：探讨TGF—β1(Transforming growth facto-r-β1-转化生长因子—β1)在实验性大鼠腮腺导管细胞、腺泡细胞的表达区别与形态学改变的关系。材料和方法：采用颈总动脉结扎法建立腮腺缺血再灌注模型，用光镜、免疫组化的方法，观察腮腺导管细胞、腺泡细胞形态学及TGF—β1的表达变化。结果：实验组在缺血再灌注早期，开始出现形态学改变，中期明显，后期渐修复。在缺血和再灌注时间均相同时，TGF—β1在导管细胞较腺泡细胞表达高，前者增殖抑制明显。结论：①实验性腮腺缺血再灌注大鼠腮腺导管细胞有形态学改变。②TGF—β1在导管细胞表达比腺泡细胞高，导管细胞可能比腺泡细胞更客易发生增殖抑制。     

部分喉切除术后喉狭窄瘢痕组织中TGF-β1和α-SMA的表达

[目的]研究喉狭窄瘢痕组织的病理变化,了解转化生长因子β1(TGF-β1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在喉狭窄瘢痕组织中表达及意义.[方法]垂直喉部分切除术后2～3个月出现喉狭窄10例和未狭窄16例喉瘢痕肉芽组织为实验组及1O例正常声带组织为对照组,进行免疫组化染色,观察组织切片中TGF-β1和α-SMA的表达,并在KONTRON IBAS 2.5全自动图像分析系统下进行阳性细胞计数.[结果]TGF-β1阳性表达主要分布于炎症细胞及成纤维细胞的胞浆,α-SMA阳性表达的主要分布于肌成纤维细胞胞浆.比较非狭窄喉瘢痕组织及正常声带组织,喉狭窄瘢痕组织的TGF-β1和α-SMA的表达均明显增强,阳性细胞数量差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]喉狭窄瘢痕组织的TGFβ1及α-SMA高表达,这些改变可能是喉狭窄发生重要内在因素.     

HBV全基因真核细胞表达载体的构建及表达

目的：构建全基因HBV真核细胞表达载体,并对其在细胞内的复制、转录、翻译进行研究。方法：采用分子亚克隆技术,将长约3.2Kb的HBV全基因克隆到真核细胞表达载体pBK-CMV折EcoPI位点,构建的pKB-HBV经FUGENE^TM6导入人肝癌细胞系SMMC－7721细胞中。结果：经PCR、RT－PCR验证pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制和转录。固相放免法显示HBV转染细胞内的HBsAg、HBeAg的合成和分泌。免疫组化法证明,胸内浆型分布为主的HBcAg的表达。结论：HBV全基因真核细胞表达载体pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制、转录及表达。     

人端粒酶启动子(hTERTp)真核表达载体的构建

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）的启动子,构建真核表达载体pEGFP—hTERT。方法以人类基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增hTERT上游序列长约1135bp的启动子片段,克隆入绿色荧光蛋白GFP的基因上游,测序鉴定。结果DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,片段长度为1135bp。结论人端粒酶启动子的真核表达载体pEGFP—hTERT构建成功,为hTERTp调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗奠定了基础。     

IgE低亲和力受体基因的克隆、表达及初步鉴定

目的 利用基因重组的方法建立IgE低亲和力受体(FceR Ⅱ)基因的原核表达系统.方法 用RTPCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞扩增FceR Ⅱ cDNA基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达载体 FceR Ⅱ-pGEX-4T-1,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta,诱导表达FceR Ⅱ蛋白,通过割胶回收纯化,并用Western blot检测FceR Ⅱ的表达.结果 测序表明所扩增FceR Ⅱ cDNA基因,与已报道的序列一致.获得的重组蛋白经Western blot鉴定可以和人IgE特异性结合.结论 成功构建了FceR Ⅱ-pGEX-4T-1表达载体,获得了能和人lgE特异性结合的重组蛋白,为下一步FceR Ⅱ单克隆抗体的制备及应用研究打下了基础.