线粒体功能障碍、α-突触核蛋白与帕金森病

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是以中脑黑质多巴胺能神经元缺失,黑质残存神经元内出现路易小体为主要病理改变的神经退行性疾病。越来越多的证据显示线粒体复合体Ⅰ功能障碍是散发性PD的核心发病机制,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)异常聚集是PD病理学级联反应的关键事件。近年来,α-Syn与线粒体功能障碍的关系尤其引人注意,但至今对它们在PD中的作用机制并不完全清楚,二者间的相互作用尚不明确。本文综述了α-Syn与线粒体在PD发病中的关键作用以及二者在PD发病中的相互作用。对α-Syn及线粒体在PD发病中发挥作用的机制深入了解将对研发新的PD治疗方法具有重要意义。     

α-突触核蛋白基因多态性与帕金森病的关联分析

目的:探讨α-突触核蛋白基因(α-synuclein gene,SNCA)rs1372525、rs3822086等位点基因多态性与新疆地区帕金森病的关联性.方法:采用病例-对照研究,收集来自新疆医科大学各个附属医院门诊及病区225例帕金森病患者及231例年龄、性别、生源地等条件与其相匹配的健康体检者,分别作为病例组及对照组;采集2组参与者外周血液,通过提取脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对2组参与者的SNCA rs1372525、rs3822086等位点进行多态分析.结果:病例组与对照组SNCA rs1372525位点分别测得AA型161、164例,AG型54、61例,GG型10、6例,等位基因A的频率分别为83.6％和84.2％,等位基因G在2组间的频率分别为16.4％和15.8％,rs1372525位点3种基因型及等位基因分布频率在帕金森病组与对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05).病例组与对照组rs3822086位点分别测得CC型47、73例,CT型115、113例,TT型63、45例,等位基因C的频率为46.4％、56.1％,等位基因T的频率为53.6％、43.9％,可见该位点rs3822086 CC基因型和等位基因C在2组间的差异无统计学意义(P＞0.05);而CT、TT2种基因型及等位基因T的分布频率在2组之间的差异有统计学意义(P＜0.05).结论:SNCArs1372525位点多态性与帕金森病的发病无关.rs3822086考虑是帕金森病发生发展中的易感位点之一.     

促进α-突触核蛋白异常聚集而致帕金森病的因素

帕金森病(PD)为多发于老年人的神经系统退行性病变,其发病率仅次于阿尔茨海默病,高发病率及致残率使其备受社会关注。PD的发病是由遗传因素及环境因素共同决定的,路易小体的出现是PD的特征性改变,而异常聚集的α突触核蛋白(α-syn)是路易小体的主要构成成分,所以α-syn的异常聚集是PD发病的核心机制。α-syn由单体形式转变为聚集状态受诸多因素影响。通过了解这些影响因素,可以使学者们更好地了解PD的发病,从而为临床治疗提供新思路。     

帕金森病患者血浆增强α-突触核蛋白寡聚体形成

目的 研究帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）患者血浆对α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的影响.方法 将重组人α-Syn加入PD和对照血浆中,37 ℃振荡孵育144 h,免疫印迹方法鉴定α-Syn寡聚体形成情况,ELISA方法分析α-Syn寡聚体形成的相对质量浓度.结果 α-Syn在 PD患者血浆中形成寡聚体含量明显高于对照组.结论 PD患者血浆可促进α-Syn寡聚体形成.     

α-突触核蛋白在大鼠脊髓的表达

目的研究α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)在正常大鼠脊髓中的表达。方法利用2种抗α-Syn单抗3D5和2E3进行免疫组化染色,观察α-Syn在脊髓的表达和分布;用免疫荧光双标方法观察α-Syn与神经肽Y(NPY)共存的情况。用Luxol fast blue染色鉴别有髓与无髓神经纤维。结果α-Syn主要存在于脊髓灰质神经元核及灰质无髓神经纤维中。富含α-Syn的神经纤维主要分布在脊髓灰质的第Ⅰ、Ⅱ层,而α-Syn核阳性神经元主要分布在第Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ层;后根第Ⅰ、Ⅱ层一小部分α-Syn阳性纤维与NPY共存;前角细胞核呈α-Syn阳性神经元胞质中存在NPY,而其他部位的α-Syn核阳性神经元胞质中无NPY。结论α-Syn存在于大鼠脊髓灰质的神经元核及无髓神经纤维中,部分阳性神经纤维和神经元胞体呈NPY免疫阳性反应。     

帕金森病患者血清对α-突触核蛋白寡聚体形成的促进作用

目的研究帕金森病(PD)患者血清对外源性α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)寡聚体形成的影响,初步分析血清促进α-Syn寡聚体形成的机制。方法将重组人α-Syn加入PD患者和对照组血清中,37℃振荡孵育,用免疫印迹方法鉴定α-Syn寡聚体的形成情况,用ELISA分析α-Syn寡聚体的形成量。结果α-Syn在血清中振荡孵育后主要形成二聚体和十四聚体。与对照组血清相比较,PD患者血清具有促进α-Syn寡聚体形成的作用。在血清中加入还原性谷胱甘肽可明显减弱PD患者血清促进α-Syn寡聚体形成的作用。结论PD患者血清促进α-Syn寡聚体的形成,其机制可能与α-Syn的氧化修饰有关。     

重组大鼠α突触核蛋白的制备与鉴定

目的克隆编码大鼠α-突触核蛋白的cDNA,探讨α-突触核蛋白基因在原核细胞中的表达过程并制备基因重组型α-突触核蛋白。方法设计合成含适当酶切位点的DNA片段作为引物,采用RT-PCR法从Wistar大鼠脑总RNA中扩增编码α-突触核蛋白的cDNA并亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),使其表达以谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白,再用谷胱甘肽-琼脂糖4B和Superdex S200纯化基因重组型α-突触核蛋白。结果核酸序列测定表明克隆的cDNA含420 bp编码140个氨基酸,重组质粒pGEX-raSYN在原核细胞中表达为可溶性组分并受IPTG诱导,纯化的目的蛋白质在SDS-PAGE上表现为单一条带,推测其相对分子质量约为18 000。每升细菌培养液可纯化目的蛋白质3 mg。Western blot分析结果表明纯化的目的蛋白质可以被抗α-突触核蛋白识别。结论大鼠α-突触核蛋白基因在原核细胞高效表达,可制备高纯度基因重组型大鼠α-突触核蛋白。     

左旋多巴对帕金森病模型大鼠结肠酪氨酸羟化酶和α-突触核蛋白表达的影响

目的探讨左旋多巴(L-dopa)对帕金森病(PD)模型大鼠结肠酪氨酸羟化酶(TH)及α-突触核蛋白(α-Syn)表达的影响。方法健康SD大鼠72只随机分为对照组、帕金森病模型组(模型组)、左旋多巴治疗组(治疗组),各组随机再分为模型制备成功后4 d、8 d 2个亚组,各12只。采用大鼠颈背部皮下注射鱼藤酮制备帕金森病模型,免疫组化法和Western blotting蛋白印迹法检测结肠TH和α-Syn表达水平。结果 1 h粪便排出量及含水量:与对照组比较,模型组、治疗组大鼠显著降低(P<0.05);与模型组比较,治疗组大鼠增加(P<0.05);与治疗4 d亚组比较,治疗8 d亚组增加(P<0.05)。免疫组化法与Western blottng检测TH、α-Syn比较:(1)与对照组比较,模型组、治疗组各时间点结肠TH阳性细胞及蛋白表达均明显减少,α—Syn阳性细胞及蛋白表达均明显增加(P均<0.05);(2)与模型组比较,治疗组各时间点结肠TH阳性细胞及蛋白表达均增多,α—Syn阳性细胞及蛋白表达均明显减少(P均<0.05);(3)与治疗4 d亚组比较,治疗组治疗8 d亚组的TH阳性细胞及蛋白表达升高(P<0.05),α—Syn阳性细胞及蛋白降低(P<0.05)。结论 PD模型大鼠结肠功能障碍的机制可能与多巴胺的减少及α—Syn水平的增多有关,左旋多巴可能通过增加多巴胺和减少α—Syn水平改善PD大鼠结肠功能障碍。     

细胞外α-突触核蛋白的特点其与帕金森病的关系

α-突触核蛋白在帕金森病的发病过程中起重要作用,其异常表达和聚集常导致多巴胺能神经元进行性变性和脱失,以及细胞内以α-突触核蛋白为主要成分的路易小体形成.传统的观点认为该蛋白仅存在细胞浆中,近来的研究发现,在细胞间质中也存在着α-突触核蛋白,其在帕金森病的发病过程中也起到一定作用.在本文中,笔者综述了细胞外α-突触核蛋白的特点、生物学意义及其与帕金森病发病的关系.     

α-突触核蛋白存在于大鼠脑线粒体中

目的研究α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)是否存在于正常大鼠脑线粒体中以及是否能够转运至线粒体内。方法用免疫印迹和免疫电镜方法检测大鼠脑线粒体中是否存在α-SYN。将人重组α-SYN与分离的线粒体孵育,用免疫印迹法检测α-SYN是否可以转运到线粒体中。结果免疫印迹和免疫电镜方法均证实α-SYN广泛存在于正常大鼠脑的线粒体中,不同脑区的α-SYN含量不同,其中纹状体、嗅球、海马和丘脑的线粒体中α-SYN的含量高于大脑皮质、脑干和小脑。人重组α-SYN与不含内源性α-SYN的分离大鼠小脑线粒体进行孵育,表明α-SYN以剂量依赖的方式转移至线粒体内。结论在正常情况下α-SYN存在于线粒体内,线粒体的α-SYN有可能源于胞质α-SYN向线粒体的转运。     

α-突触核蛋白的突变体A53T对小胶质细胞激活的影响

目的：探究重组人的野生型α-突触核蛋白(wild type alpha-Synuclein, WT α-Syn)和重组人的α-突触核蛋白突变体A53T(α-Synuclein mutant A53T, α-Syn A53T) 对原代小胶质细胞的影响。方法：无菌培养原代小胶质细胞,细胞静息状态下加药处理,通过免疫荧光染色观察小胶质细胞的形态和Western Blot半定量分析CD11b的变化。结果：高浓度的WT α-Syn可以激活小胶质细胞;CD11b蛋白表达量明显升高;而2 μmol/L和5 μmol/L的α-Syn A53T均能激活小胶质细胞,CD11b蛋白表达量均升高。结论：相同浓度的WT α-Syn和α-Syn A53T,α-Syn A53T更容易激活小胶质细胞。     

携带人alpha-突触核蛋白真核重组质粒构建及其SK-N-SH细胞表达

目的构建携带人alpha-突触核蛋白真核重组质粒,检测其在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的表达及对细胞存活率的影响。方法 PCR扩增alpha-突触核蛋白基因,产物纯化后与pcDNA3.1(+)载体进行连接反应,构建pcDNA3.1(+)/alpha-突触核蛋白真核重组质粒。Lipofectamine法转染人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,RT-PCR方法检测SK-N-SH细胞中alpha-突触核蛋白mRNA的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞存活率的影响。结果酶切鉴定及基因测序证明人alpha-突触核蛋白基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)载体中。RT-PCR结果显示该表达载体转染SK-N-SH细胞后,细胞内alpha-突触核蛋白mRNA的表达水平明显增高,MTT方法检测结果显示该表达载体转染并未引起细胞存活率的改变。结论 alpha-突触核蛋白真核重组质粒构建成功,并可在SK-N-SH细胞内表达,且对细胞的存活率不产生任何影响,从而为进一步研究alpha-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用奠定了基础。     

α-突触核蛋白促进大鼠原代培养神经元突起生长

目的研究人α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)对神经元突起生长的作用。方法原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,细胞外添加α-Syn蛋白,测定不同时间神经元突起的长度;观察添加不同浓度的α-Syn蛋白后神经元突起的生长情况。结果α-Syn处理组神经元突起的平均长度在培养1h、2h和4h时均明显大于对照组,α-Syn的这一作用可被其特异性单克隆抗体阻断;向培养基中添加不同浓度的α-Syn后,神经元突起的长度随α-Syn浓度的增加而增加。结论α-Syn具有促进神经元突起生长的作用,并且呈明显的量-效关系。     

早发型帕金森病患者红细胞α-突触核蛋白水平及临床意义研究

目的 探讨早发型帕金森病患者外周红细胞α-突触核蛋白水平是否存在特异性改变。方法 纳入47例早发型帕金森病患者,52例健康受试者。采集受试者外周静脉血标本并分离红细胞,用电化学发光免疫法检测红细胞中α-突触核蛋白水平。对其中25例早发型帕金森病患者进行随访,2年后再次采集静脉血标本和临床评估。结果 早发型帕金森病患者红细胞总体和聚集体形式的α-突触核蛋白水平均显著高于健康对照组[总体1.28(0.94, 2.13)vs 0.57(0.41, 0.70),P<0.001;聚集体202.18(152.16, 244.22)vs 128.40(107.61, 157.02),P<0.001]。2年随访后帕金森病患者运动功能和认知功能较基线无显著进展,而红细胞聚集体形式的α-突触核蛋白水平较基线时特异性升高[211.66(159.71, 263.73)vs 170.12(139.31, 233.42),P=0.046]。结论 外周红细胞α-突触核蛋白检测对于早发型帕金森病同样具有较好诊断价值,进一步证实上述指标是诊断帕金森病潜在的生物标志物。     

人α-突触核蛋白A30P突变对小鼠嗅球神经发生的影响

目的:探讨人α-突触核蛋白(SNCA)点突变A30P对成体小鼠嗅球(OB)中神经发生的影响,阐明其在退行性神经疾病发生中的作用。方法:以C57BL/6正常小鼠(C57BL)、内源性SNCA敲除小鼠(SNCA-/-)、内源性SNCA敲除与人SNCA A30P点突变敲入小鼠(A30PSNCA-/-)为实验动物,分为C57BL、SNCA-/-和A30PSNCA-/-3组,取小鼠OB冠状冰冻切片,进行形态学观察及磷酸化组蛋白3(PH3)、双皮质素(Dcx)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)免疫荧光染色,分析PH3+细胞数、Dcx+细胞的荧光强度以及DAPI染色后的细胞密度。结果:SNCA-/-和A30PSNCA-/-组小鼠OB突触球层(GL)的细胞密度轻微降低,A30PSNCA-/-组小鼠OB轻度变形,其PH3+增殖性神经元也较其他2组显著减少(P<0.05);SNCA-/-和A30PSNCA-/-组小鼠OB中神经母细胞的Dcx荧光强度轻微增加,3组小鼠OB中DAPI染色后的细胞密度未见明显变化。结论:人SNCA A30P突变能减弱成体小鼠大脑OB中的神经细胞增殖,对成体OB中的神经发生有一定抑制作用。     

129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白DELFIA检测方法的建立及初步应用

目的 建立解离-增强镧系荧光免疫分析 (dissociation enhanced lanthanide fluorescent immunoassay,DELFIA)检测129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白的方法及初步应用。方法 使用体外蛋白重组技术纯化得到人源α-syn蛋白单体(α-syn),用Polo 样激酶催化α-syn获得磷酸化α-syn单体(phosphorylated α-syn monomer,p-α-syn),用4-氧代壬烯醛制备α-syn聚集体(aggregates of α-syn,OW)及磷酸化α-syn聚集体(aggregates of p-α-syn,OP)。使用Western blotting法和间接ELISA方法验证本实验室前期制备的识别α-syn蛋白N端的多克隆抗体SN16和识别129位丝氨酸磷酸化α-syn蛋白的单克隆抗体C140S。使用SN16作为捕获抗体,C140S作为检测抗体的双抗夹心DELFIA法建立检测OP的标准曲线,并检测Thy1-α-SYN转基因小鼠血浆内OP的变化。结果 考马斯亮蓝染色和Western blotting法检测结果显示体外纯化的人源α-syn蛋白单体(17 000)纯度高,并通过催化获得了p-α-syn、OW和OP纯蛋白,均可用作建立标准曲线的标准抗原。Western blotting和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)结果显示SN16 对α-syn、p-α-syn、OW、OP这4种形式的蛋白均可识别,C140S可以识别p-α-syn和OP,说明SN16和C140S可以用作双抗夹心法的配对抗体。间接DELFIA检测结果显示C140S对OP的识别效率更好。双抗夹心DELFIA检测结果显示,SN16-C140S作为配对抗体检测标准抗原的范围为:0.625~20 ng/mL,并建立了检测OP的标准曲线。Wt及Tg组小鼠血浆中OP在12月龄均较6月龄有所增加(P<0.001),Tg组6月龄小鼠血浆中OP显著高于同月龄Wt组(P<0.001),Tg组12月龄小鼠血浆OP较Wt组有增高的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 本文建立的SN16-C140S配对的双抗夹心DELFIA体系可以检测Thy1-α-SYN转基因小鼠血浆中聚集的磷酸化α-syn变化情况。     

多巴胺对鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集的促进作用

目的:探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集过程中的作用。方法:采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,流式细胞术检测双氢罗丹明123荧光强度;Western印迹法检测胞质内α-突触核蛋白表达;免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集体。并采用多巴胺耗竭剂——利血平预处理3h,观察上述指标。结果:鱼藤酮处理24h后,PC12细胞内过氧化物水平显著升高,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,细胞内过氧化物水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05)。鱼藤酮处理后,α-突触核蛋白表达水平显著升高,胞质内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集体形成;采用利血平预处理后,α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05),α-突触核蛋白聚集体面积减小。结论:在鱼藤酮作用过程中,多巴胺可促进α-突触核蛋白表达上调及其聚集体的形成。