c-myc基因核酶对靶mRNA的切割作用

目的：构建c—myc基因核酶及其靶mRNA的体外转录载体，探讨核酶对靶mRNA的体外切割作用。方法：通过计算机分析c—myc基因mRNA的二级结构，设计核酶基因序列，采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建入pGEM3Zf( )体外转录载体，将大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段克隆入pGEM7Zf(-)体外转录载体，分别进行体外转录获得核酶及靶mRNA。在含有Mg^2 的反应体系中，进行核酶对靶mRNA的体外切割反应。结果：经限制性内切酶酶切鉴定，核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，经DNA自动序列分析仪测序分析，大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段准确克隆入pGEM7Zf(-)载体。核酶对靶mRNA的体外切割活性约为64．5％。结论：该核酶具有切割靶mRNA的活性，可进一步用于细胞内和体内研究。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因真核表达载体的构建及其在食管癌细胞中的表创

目的：构建含单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV—tk)基因的真核表达载体(pcDNA3-tk)，并观察能否在食管癌细胞株中表达。方法：将HSV—tk的cDNA亚克隆于真核表达载体pcDNA3上，构建pcDNA3-tk。后者经脂质体介导转染食管癌细胞株Eca-109，通过高剂量的G418选择培养，筛选出抗性克隆。经RT-PCR检测确定HSV—tk基因是否能在转染细胞内转录。结果：成功地构建了真核表达载体pcDNA3-tk，并且在pcDNA3-tk转染的食管癌细胞内发现tk基因的mRNA。结论：含hSV—tk基因的真核表达载体能在食管癌细胞中表达。     

锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性的影响

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ 交换器（NHE）-1表达和活性，pHi的影响。方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达，pHi和Na^ /H^ 交换活性变化。结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE-1mRNA表达减少，Na^ /H^ 交换活性降低，同时伴有pHi降低。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE-1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化。     

Effect of hammerhead ribozyme that specifically cleaves c—myc mRNA on proliferation of vascular smooth muscle cells

Ojective:To investigate the effect of hammerhead ribozyme that specifically cleaves c-myc mRNA on the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs).Methods:Based on the computer analysis of the secondary structure of c-myc mRNA,nt 2029 in rat c-myc oncogene was selected as a cleaving site for hammerhead ribozyme and the ribozyme was designed.With automatic DNA synthesizer,the two complementary DNA strands of the ribozyme were synthesized.The ribozyme gene was cloned into pGEM3Zf( ) vector and subcloned into eukaryotic expression pcDNA3 vector.The recombinant pcDNA-Rz was transfected into the cultured rat VSMCs by lipofectAMINE mediated DNA transfection protocol and individual cell clones were selected by G418.Results:The sequence of ribozyme gene inserted in pGEM3Zf( ) vector was proved to the perfectly correct.In VSMCs transfected with recombinant pcDNA-Rz, flow cytometry analysis showed that the Sphase and G2/M fractions were decreased significantly and cell proliferation stagnated in the G0/G1 phase.Conclusion:The results suggest that hammerhead ribozyme the specifically cleaves cmyc mRNA can significantly inhibit the proliferation of VSMCs.     

核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性及细胞增殖的作用

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ ’交换器-1表达和活性、pHi的影响，及其与细胞增殖的关系.方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达、PHi、pHi恢复速率、^22Na摄取量和^3H—TdR掺入量变化.结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE—1 mRNA表达、^22Na摄取量减少，同时伴有pHi降低、pHi恢复速率下降和^3H—TdR掺入量减少。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE—1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖。     

转染针对黑色素瘤抗原编码基因的短发夹RNA真核表达载体对SGC7901细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察转染针对黑色素瘤抗原编码基因(NRAGE)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对SGC7901细胞增殖及凋亡的影响.方法:用特异性shRNA 真核表达载体pSuper-EGFP-NRG转染SGC7901胃癌细胞,经G418筛选, 应用RT-PCR方法检测转染细胞NRAGE mRNA的表达,应用流式细胞术检测转染细胞增殖与凋亡.结果:体外培养的pSuper-EGFP-NRG转染的SGC7901胃癌细胞中NRAGE基因被沉默,G0～G1期、G2期细胞百分率降低,S期细胞百分率增多(P<0.05).结论:NRAGE基因参与了SGC 7901细胞周期和细胞凋亡的调控.     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

PC12-Mint2基因工程细胞株的构建

目的:构建稳定表达Mint2蛋白的PC12-Mint2基因工程细胞株.方法:用PCR方法将Mint2基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1A,构建真核表达质粒pcDNA3.1A-Mint2;采用脂质体Lipofectamine2000介导,将重组载体转染入PC12细胞,G418筛选抗性克隆,有血清培养并传代具有G418抗性的细胞,数代培养后获得工程细胞株;分别提取野生型PC12细胞和PC12-Mint2工程细胞的mRNA及细胞裂解液,RT-PCR方法检测Mint2基因是否整合入PC12细胞基因组,并用Western印迹法检测外源基因Mint2在PC12-Mint2工程细胞中是否正常表达.结果:扩增出的基因片段大小为2 253 bp;pcDNA3.1A-Mint2重组质粒酶切结果表明Mint2基因正确地插入到pcDNA3.1A载体中,测序结果正确;将pcDNA3.1A-Mint2转染PC12细胞,经G418筛选获得PC12-Mint2工程细胞株;RT-PCR结果表明Mint2基因已整合入PC12细胞,Western印迹结果显示在120 000处有特异条带,大小与Mint2蛋白理论计算值一致,表明在PC12-Mint2基因工程细胞中确实有Mint2蛋白表达.结论:本试验成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-Mint2,并获得了稳定表达Mint2蛋白的PC12-Mint2基因工程细胞株,为进一步研究Mint2生物学功能及其作用机制奠定了基础.     

SMYD3与细胞增殖相关性及其对细胞周期的影响

目的：研究SMYD3与细胞增殖间的相关性及其对细胞周期的影响。方法：应用RT-PCR对SMYD3基因在人不同组织来源肿瘤细胞系中的表达情况进行检测。通过RT-PCR从肝癌细胞SMMC7721中扩增获得人SMYD3基因并克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选建立稳定表达细胞株。RT-PCR检测转染后SMYD3的mRNA表达水平;MTT法测定细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞周期分布。结果：SMYD3在人类主要组织来源的癌细胞系中均高度表达,重组表达载体pcDNA-SMYD3构建成功。转染NIH3T3细胞后,外源SMYD3基因获得了有效的转录与稳定表达,并且S期细胞明显减少,而G2/M期细胞增多。结论：SMYD3可以通过加快细胞周期S期进程从而提高细胞增殖速度,其高度表达与细胞增殖具有广泛的相关性。     

自切割核酶介导的转基因淋巴细胞有效抑制猴免疫缺陷病毒的感染和致病

目的 获得抗猕猴免疫陷病毒（SIV）转基因的淋巴细胞,方法 将锤头型核酶切割的一段靶序列连接在核酶下游构成自切割核酶,人工合成的自切核酶基因扩增并克隆在pBluescirpt SK和Xhol-Sall 位点,通过连续4次克隆获得10拷贝核酶基因的载体,转染前测定自切割酶的体外活性并将之转移至哺乳动物表达载体上,脂质体法转染含酶基因的表达载体,转染细胞在含400mg/L G418的培养介质中筛选,转基因细胞对猴免疫缺陷病毒的抗性通过免疫荧光测定来估测,结果 37度孵育15 min后85％的十体核酶自切割成单体核酶,在初始25min的反式切割反应中尽管10体核酶摩尔数不足单体核酶十分之一,但十体核酶平均超过单体核酶13．31％的切割产物。Northern点杂交证明单体核酶基因和十体酶基因已经转入细胞并在细胞中获得表达,SIV攻毒试验表明,SIV接种6天后转染单体酶基因的细胞生长正常,不出现融合细胞,绝大多数转染十体基因的细胞生长良好,只发现极少数的融合细胞,转染单体核酶基因细胞的SIV抗原性细胞抑制率达到100％,转染十体核酶基因细胞的SIV抗原阳性细胞抑制率为91．2％,转空表达载体细胞为48％,结论 转自切割核酶基因的细胞对SIV的感染和致病均表现较强的抗性,但单体核酶比10体核酶对SIV的感染和致病表现出更好的抑制效果。     

c—myc基因特异核酶的设计及其对靶mRNA的切割

目的：针对ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列设计核酶，探讨生理温度下核酶的切割活性，方法：计算机模拟分析ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分二级结构，选择核酶切位点，设计核酶，分别构建ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列和核酶体外转录载体并经双脱氧末端终止法测定核酶序列正确无误，体外转录核酶和靶ＲＮＡ分子，生理温度下测定核酶切割活性，结果：所设计的核酶可有效地切割靶ｍＲＮＡ分子。结论：所设计的核酶在生理温度下具     

核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases

Dozensofstudieshavedemonstratedthattheab normalexpressionofmajorhistocompatibilitycomplex(MHC)Ⅱmoleculeswasassociatedwithmanydis eases ,suchasrheumaticarthritis ,immunohepatitis ,autoimmunediseaseofcentralneuralsystem[1- 3] .Morerecently ,anti nucleicacidofMHCⅡmoleculeswasshowntoinhibittheexpressionofMHCⅡmolecules,buttheinhibitoryeffectivenesswaslessthan 30 % .Therearecodominanceandmultipleal leleforMHCⅡmoleculeswhichleadtotheircompli catedpolmorphism ,soitisdifficulttorepressexpres si…     

采用多药耐药基因mRNA转染人单个核血细胞提高对化疗药物耐药性的体外研究

目的：采用将人多药耐药基因（MDR1）mRNA导入人单个核血细胞的方法,观察跨膜糖蛋白(P-gp)在转染后单个核血细胞中的表达和功能情况,并初步探讨此方法中影响P－gp表达和功能的因素。方法：体外分别合成无5′和3′UTR（非翻译区）的MDR1 mRNA[pGEM5Zf( )-MDR1]和使用Xenopusβ-globin的5′和3′UTR替代野生型5′和3′UTR的MDR1 mRNA(pT7TS-MDR1),从而构成两个试验组。然后利用脂质体为介质转染富含造血细胞的人单个核血细胞, 式细胞技术对MDR1基因的翻译产物P-gp的表达和功能进行检测。结果：转染后12h人单个核血细胞P-gp的表达：阴性对照组为2．16％,pGEM5Zf( )-MDR1组为8．94％,pT7TS-MDR1组为19．14％;转染后72h人单个核血细胞P-gp的表达：阴性对照组为2．12％,pGEM5Zf( )-MDR1组为6．12％,pT7TS-MDR1组为25．29％,pT7TS-MDR1组为35．02％。结论：转染后12h及72h两试验组都表现出P-gp的高表达,并且以pT7TS-MDR1组为优;转染后细胞对P-gp的表达及存在可以维持至少72h;表达的P-gp具有外排泵功能。MDR1 mRNA转染人单个核血细胞具有提高其对化疗药物耐药性的潜质。     

核酶对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转研究

目的：探讨核酶对膀胱癌多药耐生的逆转效应。方法：设计针对ｍｄｒ１ｍＲＮＡ１９５９位ＧＵＣ的“锤头状”（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅｌ,ＲＺ１）基因,定点克隆于逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点上,重组出带有核酶基因的逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ＲＺ１。应用脂质体ＤｏＴａｐ将ｐＬＸＳＮ－ＲＺ１导入到耐药的人膀胱癌细胞少。结论：本研究中设计的核酶能明显逆转膀胱癌细胞系多     

反义c-myc重组腺病毒载体的构建及其对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:观察反义c-myc重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用. 方法:构建大鼠反义及正义c-myc细菌质粒,并将所得细菌质粒及腺病毒E1缺失质粒导入293细胞系,经共转染得到正义及反义重组腺病毒载体. MTT法检测重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用,免疫组织化学染色检测重组腺病毒载体对c-Myc蛋白的表达. 结果:反义c-myc重组腺病毒载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖,降低气道平滑肌细胞c-Myc蛋白的表达. 结论:反义c-myc重组腺病毒载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖.     

人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的 构建含人MUC－1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察其在COS－7细胞中的表达。方法 将目的基因MUC－1克隆入pGEM-3zf(-)载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pcDNA3.1( )，构建真核表达载体pcDNA3.1( )-MUC-1。用电穿孔法将重组质粒转入COS－7细胞，以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC－1的表达。结果 酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人MUC－1全长cDNA编码序列，转染实验表明MUC－1基因能在COS－7细胞中表达。结论 人MUC－1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS－7中的表达均获成功，为基因疫苗的进一步研究奠定了基础。