中国妇女宫颈癌组织中HPV16L晚期基因克隆及重组质粒的构建

本实验采用ＰＣＲ方法，以中国妇女宫颈癌组织ＤＮＡ为模板扩增出了株ＨＰＶ１６Ｌ１晚期基因ＤＮＡ片段，扩增参数为９４℃１ｍｉｎ，５５℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，共３５个循环。将扩增产物ＨＰＶ１６Ｌ１ＤＮＡ片段与克隆载体ｐＣＲ２．１连接构建了ＨＰＶ１６Ｌ１－ｐＣＲ２．１重组质粒。     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

pQE31-HPV16 L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒以获得ＨＰＶ１６ Ｌ１活性蛋白。为进一步研制ＨＰＶ１６基因工程疫苗打下基础。方法 以克隆质粒pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检查质闰重组后序列情况。结果 ＰＣＲ结果显示扩增片断大小为１.5Kb,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约５.0Kb。大小及酶切图谱与预期相同。经测序发现插入片段两端序列无改变。结论 pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１质粒构建成功。     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获得足够量的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１融合蛋白及含ＨＰＶ１６Ｌ１ＯＲＦ序列的基因重组体。方法：通过ＰＣＲ扩增获得ＨＰＶ１６Ｌ１基因片段，将此片段插入原核细胞表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１，表达后进行菌体蛋白质Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹分析。结果：ＨＰＶ１６Ｌ１基因重组体的构建成功，克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中个有抗     

人乳头瘤病毒16型完整E6开放读码框的基因克隆和鉴定

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）基因组中扩增得到５５５ｂｐ的Ｅ６ＤＮＡ片段，并重组到载体ｐＧＥＭＥＸＴＭ－１中，构建克隆扩增质粒ｐ１６Ｅ６－Ｇ，将此重组质粒转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经菌落原位杂交鉴定和限制性酶切图谱分析，证实该产物为Ｅ６基因完整开放读码框（ＯＲＦ），从而为获得Ｅ６ＯＲＦ基因片段提供了一个高效、方便的新方法     

人乳头瘤病毒16型完整E6开放读码框的基因克隆和鉴定

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）基因组中扩增得到５５５ｂｐ的Ｅ６ＤＮＡ片段，并重组到载体ｐＧＥＭＥＸ＾ＴＭ－１中，构建克隆扩增质粒ｐ１６Ｅ６－Ｇ，将此重组质粒转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经菌落原位杂交鉴定和限制性酶切图谱分析，证实该产物为Ｅ６基因完整开放读码框（ＯＲＦ），从而为获得Ｅ６ＯＲＦ基因片段提供了一个高效、方便的新方法。     

含抑癌基因p16转移载体的构建

目的：为获得高表达有活性的ｐ１６蛋白,构建含ｐ１６ｃＤＮＡ的重组转移载体。方法：ＥｃｏＲＩｘｈｏＩ双酶切克隆质粒ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ－ｐ１６,低融点琼脂糖回收０．８ｋｂ的Ｐ１６ＣＤＮＡ片段,插入质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３,构建含Ｐ１６的重组载体ＰＸ３－Ｐ１６,并对重组子以菌落原位杂交和酶切电泳两种方法进行鉴定。结果：电泳证实低融点琼脂糖回收的片段为０．８ｋｂ。菌落原位杂交筛选８个阳性克隆,酶切电     

人乳头瘤病毒HPV16L1—E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质业中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９－７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２－８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的Ｔ－Ａ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ＰＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产竽相同粘末端的特点,     

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因 …

目的 分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标准中感染ＨＰＶ型别,选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因,将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒,命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。     

先天性长QT综合征KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆先天性长QT综合征KCNE1基因，并构建真核表达载体。方法：从人胎盘组织中提取总RNA，经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出KCNE1基因；采用T-A克隆法，将KCNE1基因克隆入pCR2．1 TOPO载体中，经限制性酶切基因重组后，构建真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，经DNA测序鉴定，用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果：采用基因克隆和重组法，得到了KCNE1真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，并在HEK293细胞中得到了表达。结论：KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建和表达为进一步的功能研究奠定了基础。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

人乳头瘤病毒基因工程疫苗的基础实验研究

人乳头瘤病毒(HPV)16型感染与宫颈癌的发生、发展密切相关,故研制HPW16型基因工程疫苗对预防HPV感染、控制宫颈癌的发生有重要意义。本研究构建HPV16 L1基因工程菌并进行了基础实验研究。首先采用PCR技术从3例宫颈癌组织中扩增和克隆了HPV16L1基因片段并进行测序。进而构建了pPIC3.5～HPV16L1真核表达工程菌、pQE31～HPV16L1和pGEX4T-HPV16LI原核表达工程菌及杆状病毒-昆虫细胞表达系统。经SDS-PAGE、Westem blot和电镜等手段证明了工程菌表达HPV16 L1蛋白的分子特性和免疫原性,而且,重组菌表达的HPV16 L1可以形成类病毒颗粒(VLP)。经免疫BALB/C小鼠可获得高效价特异血清,证实重组HPV16 L1蛋白具有良好的免疫原性。为进一步研制临床应用疫苗及血清学诊断试剂提供了实验基础。     

HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定

目的 ＨＰＶ１６Ｌ１重组蛋白的表达为研制ＨＰＶ１６Ｌ１预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础。方法 ｐＰＬＣ３．５－ＨＰＶ;１６Ｌ１／ＧＳ１１５阳笥菌株,经０．５％甲醇诱导,运用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测Ｌ１蛋白;用鼠抗ＨＰＶ１６Ｌ１单克隆抗体,经Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测蛋白的特异笥;在透射电下观察类病毒颗粒（ＶＬＰｓ）结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明,在５５ＫＤ处有诱导蛋白带的出现;经Ｗ     

扬州地方株HPV16 L1基因的克隆及序列分析

目的：了解扬州地方株HPV16L1基因结构特点，为研制HPV16疫苗奠定基础。方法：从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA，用PCR技术获得HPV16L1基因，以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1，进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析。结果：扬州地方株与德国标准株在核苷酸序列上有7处不同，其中4处由于核苷酸的改变，其编码氨基酸也相应发生变化，与标准株的同源性为99．7％；扬州地方株与中国株之间也存在1至2处核苷酸不同，但未造成氨基酸序列改变，其同源性为99．9％。结论：扬州地方株HPV16L1基因与标准株、中国株之间均存在差异，但与后者的差异极小，未造成氨基酸改变。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制，对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板，采用PCR方法扩增HPV16 E5基因，经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体，转染JMl09感受态细胞，并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达，SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋），E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒，构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染，最后用G418进行稳定表达株的筛选，并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5，在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株，RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒，HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

解偶联蛋白嵌合体及突变体的构建方法

目的：构建解偶联蛋白(UCPs) 嵌合体和突变体,为阐明解偶联蛋白家族功能结构域的研究提供条件。方法：采用普通PCR和重叠延伸PCR获得UCPs 嵌合体基因片段,分别插入pCR2.1测序载体后进行测序,再以限制性内切酶连接方式将嵌合基因定向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,获得pcDNAUCP1UCP2、pcDNAUCP2UCP1和pcDNAUCP3UCP1,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pcDNA。利用定向点突变产生pcDNA-UCP3R167G/pcDN
A- UCP3RE171/172GG,并进行测序证实。结果：PCR和酶切,获得的目的基因与嵌合基因片段中包含的碱基数量吻合;测序结果,UCPs嵌合体基因序列、突变体基因序列与预期设计完全相同。结论：成功地构建了含有UCPs 嵌合体和突变体基因重组真核表达质粒。
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pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。     

单链抗体A7基因真核表达载体的构建

[目的]构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体,为单链抗体A 7基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]应用PCR技术,从已构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2单链抗体A 7上扩增单链抗体A 7基因并纯化,将纯化后的PCR产物经EcoRⅠ和AvrⅡ双酶切后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化,再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC 9 K连接,将其产物转化至大肠杆菌DH 5α后扩增,再用AvrⅡ和EcoRⅠ酶切和测定序列检查ScFv A 7基因插入的准确性.[结果]构建pPIC 9 K-ScFv A 7重组载体,经序列测定检查核苷酸序列正确,且ScFv A 7基因准确地克隆至载体开放读码框架内.[结论]成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体.