抵抗素体外对胆管癌细胞侵袭和转移的影响及其机制

目的:观察重组人抵抗素(resistin)对胆管癌细胞系QBC939增殖、侵袭、转移及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响。方法:分别采用噻唑蓝(MTT)比色法、Matrigel侵袭实验和迁移实验检测不同浓度的抵抗素对QBC939细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;采用Western blot检测抵抗素对QBC939细胞内MMP-2蛋白表达的影响。结果:当抵抗素浓度高于10 ng/ml时,对QBC939细胞增殖具有明显的促进作用(P<0.01),并呈一定的剂量依赖性;经10、50、100 ng/ml抵抗素处理24 h后,QBC939细胞体外侵袭及迁移能力均较空白对照组明显增强(P<0.01);Western blot法检测抵抗素作用QBC939细胞24 h后MMP-2表达水平显著增加。结论:抵抗素对人胆管癌QBC939细胞的侵袭和转移能力有明显的促进作用,该作用机制可能与提高MMP-2表达水平有关。     

SiRNA抑制p63基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot检测干扰效率。噻唑蓝(MTT)和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

SiRNA 抑制 p63 基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法 荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot 检测干扰效率。噻唑蓝（MTT）和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

TRAIL受体在胆管癌组织中的表达及意义

目的 :探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)的受体在人胆管癌组织、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)的表达及其临床意义。 方法 :应用原位杂交组织化学法检测TRAIL受体mRNA在人胆管癌组织、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)中的表达。 结果 :DR4mRNA、DR5mRNA在人胆管癌组织、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)均呈阳性表达。只有 3例DcR1(3/5 2 )和 7例DcR2 (7/5 2 )在人胆管癌组织呈弱阳性表达。DcR1、DcR2 mRNA在癌旁胆管组织呈阳性表达 ,而在胆管癌细胞株 (QBC939)均不表达。 结论 :TRAIL死亡受体和诱捕受体在人胆管癌、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)的表达不同 ,这些受体表达的变化可能在调控人胆管癌凋亡中发挥重要作用。     

DHA和NS-398联合对人胆管癌QBC939细胞的抑制作用

目的 研究二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂NS-398联合对人胆管癌细胞QBC939的抑制作用。 方法 体外培养人胆管癌QBC939细胞株,分别设立DHA浓度组、NS-398浓度组、二者联合组和空白对照组,即将0、15、30、45、60、75 μg/ml浓度的DHA和0、25、50、100、150、200 μmol/L浓度的NS-398分别联合作用于胆管癌QBC939细胞;应用CCK8法检测其分别对QBC939细胞生长的相对抑制率;采用流式细胞术检测QBC939细胞的凋亡情况;应用Transwell小室检测QBC939细胞的体外侵袭情况。 结果 DHA和NS-398在体外均能够单独抑制QBC939细胞生长,45 μg/ml的DHA联合100 μmol/L的NS-398经24 h作用后,细胞生长抑制率达到90%,实验组与DHA浓度组、NS-398浓度组和空白组差异均有统计学意义(P<0.05),继续增加2种药物浓度,细胞生长抑制率变化不明显;流式细胞术显示DHA和NS-398联合能明显促进QBC939细胞早期凋亡;15 μg/ml的DHA联合50 μmol/L的NS-398经24 h作用后,对胆管癌细胞生长无明显抑制作用,但QBC939的体外侵袭能力明显降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。 结论 DHA和NS-398联合能明显抑制胆管癌QBC939细胞生长,促进胆管癌细胞早期凋亡,抑制胆管癌细胞的侵袭,二者联合对胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用可能是通过促进细胞早期凋亡实现的。      

阻断ErbB4受体对人胆管细胞癌QBC939细胞系增殖与转移的影响

目的:通过体外培养人胆管癌QBC939细胞系,阻断ErbB4受体,检测肿瘤生物学行为的改变,从而探讨人类第4表皮生长因子(ErbB4)受体介导人胆管细胞癌肿瘤生物学行为的分子机制.方法:体外培养人胆管癌QBC939细胞系细胞,分别加入终浓度为0μmol/L,1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,75μmol/L,100μmol/L的AG1478阻断胆管癌细胞ErbB4受体,使用CCK-8法测量各组胆管癌细胞增殖情况,然后利用SPSS软件计算AG1478对人胆管癌QBC939细胞的半数抑制浓度(IC50值);根据IC50值选择使用0μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,75μmol/L AG1478阻断胆管癌细胞ErbB4受体,使用划痕实验检测各组胆管癌细胞迁移能力的变化.分别使用0μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,75μmol/L浓度AG1478阻断胆管癌细胞ErbB4受体,使用Transwell小室法实验检测各组胆管癌细胞侵袭能力的变化.结果:AG1478以浓度依赖方式抑制QBC939细胞增殖,其IC50值为:49.14μmol/L;AG1478抑制ErbB4受体后,胆管癌QBC939细胞的迁移、侵袭能力减弱.结论:在体外抑制ErbB4受体能使胆管癌肿瘤细胞生长、迁移、侵袭能力减弱;ErBb4在胆管癌的发生、发展中具有重要的作用,ErbB4可能成为胆管癌分子治疗的新靶点.     

PPAR-γ配体吡咯列酮对胆管癌细胞体外侵袭力的影响及其机制

目的探讨PPAR-γ配体吡咯列酮(PGZ)对胆管癌细胞体外侵袭力的影响及机制。方法体外培养人肝门胆管癌细胞系QBC939细胞;MTT法检测PGZ对QBC939细胞的增殖抑制率;荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PGZ对QBC939细胞侵袭相关基因MMP-7、TIMP-1表达的影响;Matrigel侵袭实验和过河实验检测PGZ对QBC939细胞体外侵袭力的影响。结果MTT提示在24、48和72h干预点,PGZ显著抑制了QBC939细胞的生长(P<0.01);而12h干预点、浓度(5～40μmol/L)时,PGZ的细胞毒性作用不明显(P>0.05)。荧光定量PCR结果显示,PGZ能分别下调和上调MMP-7mRNA、TIMP-1mRNA的表达,但后者无统计学意义(P=0.125)。Matrigel侵袭实验和过河实验显示,随着PGZ浓度的升高,透过Matrigel膜的QBC939细胞数减少、过河时间延长(P<0.01),呈剂量-效应关系。结论PPAR-γ配体PGZ能抑制QBC939细胞的体外侵袭力,其机制可能与下调MMP-7的表达以及抑制QBC939细胞的运动有关。     

RNA干扰沉默Fascin基因对人胆管癌细胞QBC939侵袭力影响

目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,探讨RNA干扰沉默fascin基因的表达对人胆管癌细胞QBC939体外侵袭力的影响.方法 采用常规方法培养QBC939细胞,将其分为三组,实验组和对照组分别转染fascin shRNA慢病毒载体和shRNA阴性对照慢病毒载体,空白组不做处理.Western blot检测各组fascin mRNA和蛋白的表达情况;通过Transwell侵袭试验检测各组细胞在体外的侵袭能力.结果 Western blot检测发现,实验组fascin基因的表达明显低于空白组及对照组,差异有显著性(P ＜0.05);Transwell侵袭试验检测发现实验组侵袭能力明显低于其余两组,差异有显著性(P＜0.05)).结论 慢病毒介导的shRNA能有效地沉默Fascin基因在胆管癌QBC939中的表达,能有效抑制胆管癌细胞的侵袭能力.     

PPAR-γ经其配体激活后对胆管癌细胞侵袭力的影响及相关基因表达的调控

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)经其配体吡咯列酮(pioglitazone,PGZ)激活后,对胆管癌细胞体外侵袭力的影响及机制.方法 体外培养人肝门胆管癌细胞系QBC939细胞.实验分为实验组(又分为不同PGZ浓度组)和对照组(无PGZ干预);MTT法检测PGZ对QBC939细胞的增殖抑制率;荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PGZ对QBC939细胞基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)表达的影响;Matrigel侵袭实验和过河实验检测PGZ对QBC939细胞体外侵袭力和运动能力的影响.结果 MTT结果显示干预12 h、其PGZ 5～40 μmol/L时,细胞毒性作用不明显(P＞0.05).荧光定量PCR结果显示,PGZ能分别下调和上调MMP-7 mRNA、TIMP-1 mRNA的表达,但TIMP-1 mRNA在实验组和对照组之间的差异无统计学意义.Matrigel侵袭实验和过河实验显示,随着PGZ浓度的升高,透过Matrigel膜的QBC939细胞数减少、过河时间延长,有剂量-效应关系(P＜0.01).结论 PPAR-γ经其配体PGZ激活后能抑制QBC939细胞的体外侵袭力,其机制可能与调控MMP-7的表达及抑制细胞运动有关.     

RhoC基因对胆管癌细胞株QBC939细胞增殖和cyclinD1基因的影响

目的研究RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株的增殖及cyclinD1 mRNA表达的影响。方法将正、反义RhoC cDNA真核表达载体,转染人胆管癌细胞QBC939,检测细胞生长曲线,RT-PCR检测cyclinD1在QBC939细胞、转染空载体的QBC939细胞(QBC939-V)、转染正义RhoC的QBC939细胞(QBC939-S)、转染反义RhoC的QBC939细胞(QBC939-AS)的mRNA相对表达量。结果与QBC939及QBC939-V对照细胞相比,QBC939-S体外生长较快,QBC939-AS体外生长较慢,cyclinD1表达在QBC939-AS与对照组减少(P0.05),cyclinD1表达在QBC939-S与对照组增加(P0.05)。结论 RhoC可能通过调节cyclinD1来调控QBC939的增殖能力。     

FTY720对胆管癌细胞系QBC939增殖及侵袭的影响

目的：探讨FTY720对体外培养QBC939细胞系增殖及侵袭的影响。方法：体外培养QBC939细胞系,将其分为对照组、FTY720不同浓度给药组。通过MTT法、流式细胞仪检测周期和凋亡、细胞侵袭等实验观察FTY720对QBC939细胞系增殖及侵袭的影响。结果：当FTY720浓度为2400 ng/ml时,体外培养的QBC939细胞系的增殖受到明显抑制,抑制率为65．4％（ P〈0．05）;流式细胞仪检测提示QBC939细胞系被阻滞于G1期,并促进其发生凋亡;侵袭实验显示FTY720可以明显抑制QBC939细胞系的侵袭,当FTY720浓度为2400 ng/ml时,侵袭抑制率可达80％。结论：FTY720可抑制体外培养QBC939细胞系的增殖,诱导该肿瘤细胞凋亡,并且抑制其侵袭。     

吡格列酮对肝门部胆管癌QBC939细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响

目的：探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）配体吡格列酮（pioglitazone,PGZ）对胆管癌细胞增殖、凋亡和体外侵袭力的影响．方法：体外培养人肝门胆管癌QBC939细胞;采用流式细胞技术与TUNEL酶标记法检测PGZ对QBC939细胞增殖和凋亡的影响．通过Matrigel侵袭实验和过河实验检测PGZ对QBC939细胞体外侵袭力和运动能力的影响．结果：流式细胞仪分析显示,PGZ能明显抑制QBC939细胞增殖,使其停滞于G2／M期,促使诱导细胞凋亡;TUNEL酶标记显示凋亡的QBC939细胞出现凋亡小体;Matrigel侵袭实验和过河实验显示,随着PGZ浓度的增加,透过Matrigel膜的细胞数减少,过河时间延长（P〈0．01）,呈剂量一效应关系．结论：PGZ能明显抑制QBC939细胞增殖,诱导细胞凋亡,对QBC939细胞的体外侵袭力有明显的抑制作用．PPAR-γ配体PGZ有望成为治疗胆管癌新的切入点．     

Influence of Photodynamic Therapy on Apoptosis and Invasion of Human Cholangiocarcinoma QBC939 Cell Line

Objective To investigate the effect of photodynamic therapy (PDT) mediated by hematoporphyrin derivative (HPD) on apoptosis and invasion of cholangiocarcinoma QBC939 cell lines. MethodsIn vitrocultured cholangiocarcinoma QBC939 cell line was exposed to 2, 4, 6, 8, 10, 12, and 14μg/ml HPD with 5, 10, and 15 J/cm2 light intensity, respectively. The optical density at 450 nm of the QBC939 cells was measured by CCK8 assay and its growth inhibition ratio was calculated. Flow cytometry and transwell migration assay were applied to detect cell apoptosis and invasion respectively. RT-PCR and immunocytochemistry analyses were used to detect expressions of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), cyclooxygenase-2 (COX-2), and proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was carried out to examine the secretion of VEGF-C and COX-2 in QBC939 cells. Results Exposure to HPD-PDT can significantly suppress the growth of QBC939 cells (allP<0.05). HPD-PDT can promote apoptosis of QBC939 cells at the early stage. When the concentration of HPD was 2μg/ml and light irradiation was 5 J/cm2, HPD-PDT had no obvious inhibitory effect on QBC939 cell growth, but can obviously inhibit cell invasion, and significant difference was observed between the HPD-PDT and control groups (P<0.01). The HPD-PDT can reduce the mRNA and protein expressions of VEGF-C, COX-2, and PCNA, and decrease the secretion of VEGF-C and COX-2 in QBC939 cells. Conclusion PDT could promote apoptosis and inhibit growth and invasion of cholangiocarcinoma cells QBC939in vitro.     

内脏脂肪素对巨噬细胞MMP-9的作用及其机制探讨

目的 研究内脏脂肪素（visfatin）对巨噬细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的作用及其机制。方法体外诱导THP-1单核细胞转化为巨噬细胞。为明确visfatin对MMP-9的作用,细胞分为两组：①巨噬细胞+visfatin 12 h组;②巨噬细胞+visfatin24 h组,两组的visfatin的质量浓度均为：0（对照组）、50、100、200、400 ng/mL。采用RT-PCR和Western blotting测定MMP-9基因和蛋白表达,明胶酶谱法检测MMP-9的活性。为明确visfatin对MMP-9的作用机制,细胞分为五组：①巨噬细胞未加刺激组（对照组）;②巨噬细胞+ MAPK p38、ERK1/2、JNK信号通路抑制剂预处理1 h后加visfatin（200 ng/mL）24 h组;③巨噬细胞+过氧化物酶体增殖剂活化受体（PPARγ）天然及人工配体/ RXR配体预处理1 h后加visfatin（200 ng/mL）24 h组;④巨噬细胞+visfatin（200 ng/mL）24 h组（Vis200组）;⑤巨噬细胞+visfatin（200 ng/mL）刺激不同时间组（5、10、15、30、60 min）。Western blotting检测MMP-9蛋白和PPARγ蛋白表达及visfatin刺激下巨噬细胞p38、ERK1/2、JNK MAPK磷酸化水平。结果 Visfatin能促进MMP-9基因及蛋白表达（P<0.05,P<0.01）,同时增强了MMP-9的活性（P<0.01）。p38 MAPK、ERK1/2 MAPK通路抑制剂及RXR配体抑制visfatin对MMP-9表达具有上调作用;visfatin能促进p38 MAPK和ERK1/2 MAPK的磷酸化,但不影响PPARγ蛋白的表达。结论 Visfatin增加了巨噬细胞炎症因子的表达,该作用与p38 MAPK和ERK1/2MAPK信号通路有关;RXR可能参与了该过程。     

TRAIL联合5-氟脲嘧啶体外杀伤胆管癌细胞作用的研究

目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对人胆管癌的作用及联合化疗药物5-氟脲嘧啶(5-FU)共同作用胆管癌细胞对TRAIL抗瘤活性的影响。方法:应用四氮唑蓝快速比色(MTT)检测单独应用不同浓度TRAIL(1、10、100、1000ng/ml)及不同浓度(1、10、100、1000ng/ml)TRAIL 10mmol/ml5-FU对胆管癌细胞QBC939活性的抑制作用。结果:单独应用(1、10、100、1000ng/ml)TRAIL作用于QBC939细胞后抑制率分别为15.6%、31.2%、37.5%、40.6%(1、10、100、1000ng/ml)TRAIL 10mmol/ml5-FU作用于QBC939细胞后抑制率分别为46.9%、62.4%、68.7%、78.1%,5-FU与TRAIL联合应用对QBC939细胞抑制率明显高于单独应用TRAIL(P<0.05)。结论:TRAIL通过诱导胆管癌细胞凋亡而起到抑癌作用,化疗药物5-FU能加强TRAIL的抗癌活性。     

Effect of ligand pioglitazone activating PPAR-gamma on the invasiveness of cholangiocarcinoma cell in vitro and the expression regulation of related genes]

OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of ligand pioglitazone (PGZ) activating PPAR-gamma on the invasiveness of cholangiocarcinoma cell in vitro. METHODS: Human hilar cholangiocarcinoma cell line QBC939 was selected and cultured in vitro for this research. The rate of QBC939 cell growth inhibition was detected by MTT, and the influence of PGZ on the expression of MMP-7 mRNA and TIMP-1 mRNA was measured by using FQ-PCR. The in vitro invasiveness and mobility of QBC939 were quantified by Matrigel invasion assay and crossing-river test. RESULTS: Among the low concentration (5 micromol/L-40 micromol/L) groups at the point of 12-hours, PGZ did not show to inhibit significantly the growth of QBC939 cells (P>0. 05). However, the PGZ could down-regulate the expression of MMP-7 mRNA in QBC939 cells (P<0. 01), and up-regulate the TIMP-1 mRNA expression to be without obvious statistics significance (P>0. 05). At last, PGZ could reduce the number of QBC939 cell breaking through the matrigel and prolonging the time of crossing-river significantly (P< 0. 01) in a dose-dependent manner. CONCLUSION: For ligand PGZ to activate PPAR-gamma can inhibit the invasiveness of QBC939 cells in vitro via regulating the expression of MMP-7 and the mobility of QBC939 cells probably.     

低浓度乙醇预防胆管癌术后复发的可行性研究

目的探讨低浓度乙醇预防胆管癌术后复发的可行性.方法以不同浓度乙醇直接作用于培养的胆管癌细胞系QBC939细胞,MTT法筛选抑制肿瘤细胞增殖的乙醇浓度.经不同浓度乙醇预处理15min的QBC939细胞,接种于裸鼠皮下,通过裸鼠种植瘤模型筛选乙醇抑制肿瘤细胞体内生长的安全浓度.将筛选出的安全浓度乙醇蒸馏水溶液注射于大鼠腹腔,观察其对动物生命体征及腹腔脏器的影响.结果乙醇对胆管癌细胞系QBC939细胞的半数抑制浓度(IC50)为1.8%-2.2%,0.5%以上浓度的乙醇即可显著抑制肿瘤细胞生长;15%乙醇预处理过的肿瘤细胞接种于裸鼠皮下,15d后未见肿瘤结节生长;15%浓度乙醇蒸馏水溶液10ml注射大鼠腹腔后未见其对动物生命体征及腹腔脏器造成显著影响.结论低浓度乙醇可有效抑制胆管癌细胞生长,对动物生命体征及腹腔脏器安全,具有术中浸泡腹腔预防胆管癌术后复发的潜在应用价值.     

低氧对胆管癌细胞增殖的影响及与HIF-1α表达的关系

目的 建立缺氧模型,观察缺氧对QBC939胆管癌细胞生长和HIF-1 α表达的影响.方法 利用氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)模拟缺氧诱导,MTT观察缺氧诱导对胆管癌细胞增殖的影响,用流式细胞术观察缺氧对细胞周期的影响,利用Western Blot观察缺氧诱导对胆管癌细胞HIF-1 α表达的影响.结果 CoCl2(0μmol/L,50μmol/L,100μ mol/L,200μ mol/L,400μmol/L)浓度依赖性诱导胆管癌细胞增殖;CoCl2(200μmol/L)处理48 h组QBC939胆管癌细胞G1期显著减少,处理72 h组G1期显著减少的同时S期和G2显著增加;CoCl2(50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L)处理72 h,HIF-1 α表达显著增加,并随CoCl2浓度增加显著增强.结论 缺氧可诱导胆管癌细胞增殖与增加HIF-1α表达相关.