晚期糖基化终产物对内皮细胞Connexin40基因表达的影响

目的 研究晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白Connexin40 基因表达的影响.方法 D- 葡萄糖孵育牛血清白蛋白制备糖基化牛血清白蛋白作为晚期糖基化终产物.体外常规培养的人脐静脉内皮细胞分为4组,分别为对照组、100mg/L AGEs 干预组、200mg/L AGEs 干预组和400mg/L AGEs 干预组,干预24h 后通过RT-PCR 方法检测各组Connexin40 基因mRNA 的表达有无差异;通过免疫细胞荧光方法检测对照组和200mg/LAGEs 干预组之间Connexin40 基因蛋白的表达水平有无差异.结果 不同浓度(100、200、400mg/L)的AGEs 干预24h 均能引起人脐静脉内皮细胞Connexin40 基因mRNA 的表达减少(均P＜0.01);200mg/L 的AGEs 干预24h 引起人脐静脉内皮细胞Connexin40基因的蛋白表达减少(P＜0.01).结论 AGEs 体外短期干预可引起人脐静脉内皮细胞Connexin40 基因的mRNA 和蛋白表达水平减少.     

C反应蛋白对小鼠主动脉内皮细胞胞内游离钙的影响

目的:研究C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)对小鼠主动脉内皮细胞胞内游离钙[Ca2+]i的作用?方法:原代培养小鼠主动脉内皮细胞,取生长状态良好的内皮细胞分为对照组(未加CRP)和不同浓度CRP处理组,25 min后观察各组内皮细胞[Ca2+]i?将内皮细胞用1 μmol/L阿托伐他汀预处理30 min后,加入100 mg/L CRP,观察阿托伐他汀对CRP作用的影响?结果:与对照组相比,CRP可显著升高内皮细胞胞内[Ca2+]i并呈剂量依赖关系;阿托伐他汀可明显降低CRP引起的[Ca2+]i升高?结论:CRP可导致和加重小鼠主动脉内皮细胞的炎症反应,阿托伐他汀可部分拮抗CRP的致炎作用?     

人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.     

梗死患者循环白细胞对内皮细胞金属蛋白酶9表达的影响

目的观察脑梗死患者循环白细胞对培养内皮细胞金属蛋白酶(MMP)-9表达的影响,探讨循环白细胞及内皮细胞在脑梗死病理机制中的作用.方法采用细胞培养及免疫荧光技术,分别将6例脑梗死患者及6例正常人循环白细胞与内皮细胞联合培养,激光共聚焦成像定量测定内皮细胞MMP-9的表达水平.结果与脑梗死患者循环白细胞联合培养的内皮细胞均荧光着色,显示MMP-9中度～强度表达,表达部位主要在胞浆,而与正常人白细胞联合培养的内皮细胞则基本无荧光着色;激光共聚焦成像显示脑梗死患者组荧光强度值为131±34,正常人组为20±8,两组比较P<0.001,差异有显著意义.结论提示脑梗死患者循环白细胞处于炎性状态,可刺激内皮细胞表达MMP-9,并可能由此导致血浆MMP-9水平增高,抑制循环白细胞活性及血管内皮细胞MMP-9的表达,应成为脑梗死防治的重要有效途径之一.     

急性冠脉综合征患者血清中可溶性OX40配体、IL-6等炎性介质水平观察

目的通过检测患者血清可溶性OX40配体(s OX40L)、白细胞介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)和可溶性血管间黏附分子1(s VCAM-1)的表达情况,探讨预测急性冠脉综合征的炎性指标。方法分别检测急性冠脉综合征组(ACS)、稳定性心绞痛(SAP)组和对照组血清中s OX40L、IL-6、CRP和s VCAM-1含量。结果 ACS组和SAP组s OX40L、IL-6、CRP和s VCAM-1水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);ACS组s OX40L、IL-6和CRP水平明显高于SAP组,差异有统计学意义(P<0.05);ACS组s VCAM-1水平高于SAP组,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论患者血清s OX40L、IL-6、CRP和s VCAM-1表达水平的升高可作为急性冠脉综合征的早期临床辅助诊断。     

CD40-CD40L系统与斑块稳定性的相关性研究

目的:研究CD40-CD40L系统在兔腹主动脉粥样硬化斑块进展过程中的表达以及与斑块稳定性的相关性.方法:50只健康新西兰大白兔,随机均分为10组:正常对照1～5组(C1～5组)、动脉粥样硬化模型1～5组(AS1～5组).C1～5组分别予兔标准饲料喂养至8周、10周、12周、14周、16周取腹主动脉标本;AS1～5组均在高脂饲养1周后予腹主动脉球囊导管损伤术造模,并分别持续高脂饮食至8周、10周、12周、14周、16周取标本.各组均于实验前及取标本前检测血清C反应蛋白(CRP),各组腹主动脉标本通过免疫及特殊染色定位、光镜下摄片并计算机图像分析软件测定斑块内CD40、CD40L、MMP-1阳性染色的面积占血管内膜面积百分比值及胶原/脂质含量比值,分析CD40-CD40L系统的表达与斑块稳定性的相关性.结果:AS1～5组均形成腹主动脉粥样硬化斑块.与C1～5组对应比较,AS1～5各组血清CRP均显著增高(P＜0.01),斑块内CD40、CD40L、MMP-1的表达显著增加(P＜0.01).在动脉粥样硬化进程中,CD40、CD40L表达与CRP、MMP-1表达呈正相关,与胶原/脂质含量比值负相关.结论:斑块中CD40-CD40L系统表达随着动脉粥样硬化进展而逐渐增高,其高表达与斑块的不稳定性增加密切相关.     

急性冠脉综合征患者循环血中OX40L高表达的临床价值

目的 探讨急性冠脉综合征(ACS)患者外周血淋巴细胞OX40配体(OX40L)表达及血清可溶性OX40L(sOX40L)水平变化的临床意义.方法 应用间接免疫荧光流式细胞术和ELISA分别对正常对照组 20例、稳定型心绞痛(SA)组20例、ACS组40例的外周血淋巴细胞OX40L表达及血清sOX40L水平进行检测,免疫透射比浊法检测血清C-反应蛋白(CRP).结果 ACS组外周血淋巴细胞OX40L表达明显高于SA组和对照组(P<0.01),SA组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);ACS组血清sOX40L水平明显高于SA组和对照组(P<0.01),SA组与对照组相比差异无统计学意义(P >0.05);ACS组血清CRP 水平明显高于SA组和对照组(P<0.01),SA组与对照组相比差异无统计学意义(P >0.05).血清sOX40L水平与CRP呈正相关(r =0.79,P<0.001),血清sOX40L水平与冠脉病变复杂狭窄数呈正相关(r =0.72,P <0.001).结论 ACS患者外周血淋巴细胞OX40L表达及血清sOX40L水平均明显升高,提示sOX40L在ACS的发生和发展中具有重要作用,可作为预测ACS的新指标.     

OX40/OX40L mRNA在实验性变态反应性 神经炎中的动态变化

目的：研究Oxford 40(OX40)和Oxford 40 ligand(OX40L)mRNA在实验性变态反应性神经炎(experimental allegic neuritis, EAN)大鼠坐骨神经、脾脏、外周血和淋巴结中的动态变化。 方法：36只Lewis大鼠随机分为EAN模型组和完全弗氏佐剂对照组（CFA组）。分别在第9天、第17天、第26天处死动物,采用反转录聚合酶链反应技术检测坐骨神经根、脾脏、外周血单个核细胞和淋巴结中OX40和OX40L mRNA的表达水平。结果：EAN组大鼠在抗原免疫后第17天达到发病高峰,OX40和OX40L mRNA在第9天（发病早期）和第17天时表达均较高,与第26天（恢复期）相比,差异有统计学意义（P＜0.05）,各时间点与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）;CFA组大鼠无症状;EAN组中OX40和OX40L mRNA在坐骨神经和淋巴结中各时间点表达均升高,在外周血单个核细胞中微量表达。结论：OX40/OX40L可能与EAN发病有关。     

氯化高铁血红素对ADMA所致内皮细胞损伤的保护作用

目的 研究氯化高铁血红素(Hemin)对非对称二甲基精氨酸(ADMA)诱导的血管内皮损伤的保护作用及其与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的关系.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),MTT法检测Hemin(5～20μmol/L)对ADMA(3～30μmol/L)诱导细胞损伤的影响,Westem blot法检测胞内MMP-9蛋白表达水平,RT-PCR技术评价MMP-9、iNOS及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)mRNA的表达量,ELISA法检测细胞上清波肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平变化.结果 ADMA(3～30 μ mol/L)能使细胞活性降低,其损伤呈剂量依赖性,10μmol/L的ADMA显著升高了MMP-9、iNOS、MCP-1和TNF-α的表达水平(P＜0.01).而10μmol/L的Hemin预处理能明显干预ADMA对细胞活性的影响,并能下调ADMA诱导的MMP-9、iNOS、MCP-1和TNF-α的表达,与对照组相比差异具有显著性(P＜0.01).结论 Hemin对ADMA所致内皮细胞损伤有保护作用,且与MMP-9和iNOS水平降低有密切关系.     

C6胶质瘤血管通透性改变与MMP-9、iNOS表达的相关性研究

目的研究C6脑胶质瘤的不同区域BBB通透性改变与相关功能信号蛋白表达的关系。方法运用中晚期SD大鼠C6脑胶质瘤动物模型,以肿瘤、邻近肿瘤脑组织(BAT)、远隔肿瘤脑组织(BDT)和正常脑组织(NBT)为研究热点区,通过免疫组化分析内源性血清清蛋白血管外渗,判定BBB破坏程度;免疫组化法测定C6胶质瘤MMP-9和iNOS表达,分析MMP-9i、NOS活性与微血管通透性改变之间的关系。结果中-强度清蛋白弥散沉积于C6胶质瘤间质中,BAT弱阳性,BDT与NBT呈阴性(P<0.05);C6脑胶质瘤中iNOS主要为轻度-中度表达,肿瘤血管内皮细胞呈强着色;MMP-9主要呈中度-强表达,侵袭边缘瘤细胞和血管内皮细胞呈强染色;BAT区多有iNOS与MMP-9轻度表达,NBT为阴性(P<0.05)。不同区域清蛋白渗出与iNOS、MMP-9表达均呈显著正相关(P<0.05)。结论C6脑胶质瘤微血管通透性增高,MMP-9和iNOS参与介导了肿瘤血管内皮屏障功能受损。     

OX40/OX40L与疾病

OX40/OX40L是机体免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子,参与T细胞的活化、增殖和迁移,以及生发中心的形成和树突状细胞的分化成熟。在介导肿瘤免疫应答和自身免疫疾病的发生、发展中具有重要作用。OX40只表达于活化的T细胞表面,且主要是CD4+T细胞。OX40+T细胞是抗原特异性T细胞,集中于淋巴组织的T细胞区和外周的炎性位点,非炎性相关组织及外周血中很少出现,有很强的区域特异性。OX40L能协同刺激T细胞的活化,促进B细胞产生高效价抗体和类别转化,介导OX40+T细胞向炎症部位浸润。     

OX40／OX40L在动脉粥样硬化不稳定斑块中的作用

动脉粥样硬化（As）是一种慢性炎症疾病^[1]，炎症反应参与了在As的发生发展、斑块破裂及血栓形成的所有阶段。T细胞的激活是AS发生、发展中重要的炎性致病因素^[2]。体内存在多种激活T细胞的受体一配体信号通路，近年来OX40／OX40L受体一配体途径与AS的发生、发展逐渐受到关注。     

OX40/OX40L与冠心病关系研究进展

最近的研究显示[1],炎症在冠状动脉粥样硬化性心脏病及其他动脉粥样硬化性疾病中扮演很重要的角色。目前愈来愈多的证据表明,动脉粥样硬化是发生在血管壁的慢性炎症过程,基本病理损害符合慢性炎症疾病的特点[2,3]。涉及多种炎症细胞、     

系统性红斑狼疮患者外周血OX40和OX40L分子的表达

目的探讨OX40和OX40L分子在系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血T淋巴细胞和单核细胞上的表达及其在SLE发病机制中的可能作用。方法采用流式细胞术检测26例SLE患者和15例健康志愿者外周血T细胞上OX40和单核细胞上OX40L的表达水平。结果 SLE患者外周血CD4＋T细胞OX40表达水平为8.91±5.07,显著高于正常对照组（3.46±1.72）（P〈0.05）,而CD8＋T细胞OX40表达水平为3.89±1.94,与对照组（3.34±1.44）的差异无统计学意义（P〉0.05）;外周血单核细胞上OX40L表达水平（31.23±10.05）显著高于正常对照组（21.01±6.92）（P〈0.05）。结论 SLE患者外周血T细胞和单核细胞上存在OX40和OX40L的异常表达,提示OX40/OX40L信号在T细胞与单核细胞相互作用过程中可能有助于T细胞的持续活化,从而参与SLE的发生发展。     

协同刺激分子OX40/OX40L在强直性脊柱炎患者外周血中的表达

目的 探讨协同刺激分子OX40及其配体OX40L在强直性脊柱炎（AS）患者外周血单个核细胞（PBMC）中的表达及其临床意义。方法 收集2017年10月～2019年10月我院收治的AS患者血液标本94例（AS组）,其中稳定期患者52例,活动期患者42例,另取门诊同期健康体检者血液标本60例为对照组。分离PBMC,采用流式细胞仪检测OX40和OX40L在CD+4T细胞和CD+19B细胞表面的表达变化,收集受试者所有临床检查资料,采用Spearman法分析PBMC中OX40和OX40L表达与AS患者Bath强直性脊柱炎指数评分（BASDAI）、Bath强直性脊柱功能指数（BASFI）、高敏C反应蛋白（hs CRP）、血细胞沉降率（ESR）及球蛋白（GLB）水平的相关性。结果 稳定期、活动期AS患者与对照组年龄、性别、BMI、吸烟史比例比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较,稳定期、活动期AS患者血清hs CRP水平、外周血WBC、N、ESR、GLB水平、CD+4T细胞表面OX40、CD+19B细胞表面OX40L表达率依次增加（均P＜0.05）。 外周血中CD+4T/ OX40表达率、CD+19B/OX40L表达与AS患者BASDAI、BASFI、血清hs CRP、外周血N、ESR呈正相关（均P＜0.05）;外周血中CD+4t/OX40、CD+ 19B/OX 40L表达与GLB无明显相关性（均P＞0.05）。结论 协同刺激分子OX40/OX40L在AS患者外周血中表达增加,可能与临床分期及疾病活动度有关。     

Blockade of the OX40/OX40L pathway and induction of PD-L1 synergistically protects mouse islet allografts from rejection

Background OX40/OX40 ligand （OX40/OX40L） and programmed death-1/programmed death ligand-1 （PD-1/PD-L1） co- stimulator/signals play important roles in T cell-induced immune responses. The aim of this study was to investigate the roles of OX40/OX40L and PD-1/PD-L1 costimulatory pathways in mouse islet allograft rejection. Methods Lentiviral vectors containing OX40L siRNA sequences and an adenovirus vector containing the PD-L1 gene were constructed. The streptozotocin-induced model of diabetes was established in C57BL/6 （H-2b） mice. Diabetic C57BL/6 mice were randomly allocated into five groups： group 1, untreated control; group 2, Ad-EGFP treatment; group 3, Ad-PD-L1 treatment; group 4, OX40L-RNAi-LV treatment; group 5, OX40L-RNAi-LV combined with Ad-PD-L1 treatment. Lentiviral vector and the adenovirus vector were injected, singly or combined, into the caudal vein one day before islet transplantation. The islets of DBA/2 （H-2d） mice were transplanted into the renal subcapsular space of the diabetic recipients. Recipient blood glucose and the survival time of the allografts were monitored. Antigen-specific mixed lymphocyte reaction was also evaluated.     

CD40-CD40L与OX40在急性髓性白血病中的表达意义

目的:检测在急性髓性白血病细胞中CD40、CD40L、OX40的表达并探讨其临床意义.方法:应用流式细胞仪检测46例未经治疗的初诊急性髓性白血病患者骨髓单个核细胞表面CD40、CD40L、OX40的表达,分为四组:仅表达CD40的患者组(①组)、表达CD40+CD40L+OX40-的患者组(②组)、三种抗原全部表达组(③组)和全部不表达组(④组).利用SPSS统计软件分析.结果:在有高白细胞表现的患者中,②组的发病率(100%)最高;在有血小板减少表现的患者中,①组的发病率(100%)最高;在有脾大表现的患者中,④组的发病率(6.7%)最低.结论:CD40的单独表达可能使白血病患者血小板的降低更加严重,而当合并CD40L表达时,会减少血小板低下的发生率.CD40的表达能增加患者伴有脾大表现的可能性.     

人OX40融合蛋白的表达及其纯化

目的表达含有人OX40胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为下一步制备抗人OX40单克隆抗体及鉴定打下良好的基础。方法采用冰冷热击法将测序正确的pET32a—OX40胞外段的重组质粒转入表达菌株BL21（DE3）的感受态细胞,接种于含氨苄青霉素的培养基筛选出阳性克隆。将阳性克隆细菌用IPTG诱导培养,收集不同时间的培养产物,离心分离菌体,取菌体超声破菌,离心收集胞质上清和包涵体沉淀,进行SDS．PAGE分析,观察不同时间条件对目的蛋白表达的影响及目的蛋白分布情况,筛选优化表达条件。采用Ni离子亲合层析柱纯化目的蛋白,然后使用超滤管对蛋白进行脱盐处理,并用核酸蛋白检测仪测定目的蛋白的浓度。结果筛选到表达pET32a．OX40的阳性菌株。SDS．PAGE电泳表明,含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后,在蛋白Marker的31．0～42．7kD之间出现了新的融合蛋白带,在胞质和包涵体中均有目的融合蛋白的表达。优化表达条件分析表明,在诱导的不同时间内新蛋白的表达量没有明显差别。用Ni离子亲和层祈柱纯化的蛋白经超滤管进行脱盐处理后,获得的目的蛋白含量为56．266g／L。结论成功获得表达pET32a—OX40的阳性菌株;表达产物经Ni离子亲和层析柱层析处理可获得纯度较高的目的蛋白。