携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（eNOS)基因的重组腺病毒载体。方法：将eNOS cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pCA14，得到重组质粒pCA14-CMV-eNOS。采用磷酸钙－DNA沉淀法将质粒pCA14-CMV-eNOS与腺病毒拯救质粒pBHG10共转染293细胞，通过同源重组，生成带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（AdCMVeNOS)。eNOScDNA重组进入腺病毒E1区并受CMV启动子控制。结果：经形态学、病毒DNA酶切、PCR和RT－PCR等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有eNOS基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)的表达。方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定;用Pme I线性化后去磷酸化的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ 5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。用重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP对MSCs进行转染,并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果:pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ 5183中成功地发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论:采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中,并得到有效表达,且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况,这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。     

携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）基因的重组腺病毒载体。方法：将ｅＮＯＳ　ｃＤＮＡ克隆于腺病毒穿梭质粒ｐＣＡ１４，得到重组质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ。采用磷酸钙ＤＮＡ沉淀法将质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ与腺病毒拯救质粒ｐＢＨＧ１０共转染２９３细胞，通过同源重组，生成带有ｅＮＯＳ基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶｅＮＯＳ）。ｅＮＯＳｃＤＮＡ重组进入腺病毒Ｅ１区并受ＣＭＶ启动子控制。结果：经形态学、病毒ＤＮＡ酶切、ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有ｅＮＯＳ基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

腺病毒介导的人内皮型——-氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的：研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶（human endothelial nitric oxide synthase，heNOS）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的表达。方法：体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定；用PmeI线性化后去磷酸化的pShuttle—heNOS—EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy--1的感受态BJ 5183，使其在细菌内发生同源重组，获得阳性重组质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经Pac I酶切，转人AD 293细胞，包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。用重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP对MSCs进行转染，并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果：pShuttle—heNOS—EGFP与pAdeasy--1在BJ 5183中成功地发生了同源重组，得到了重组腺病毒质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论：采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中，并得到有效表达，且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况，这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。     

PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒

目的:将PCR扩增产物人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)cDNA定向克隆到载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以构建重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。方法:在扩增目的基因的PCR引物5′端加上与线性化载体同源的15个碱基,使PCR反应产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。EcoRⅠ酶切质粒pHCM-Vsp1A-heNOS,回收heNOS cDNA作为模板,进行PCR扩增。将纯化的PCR产物heNOS cDNA与EcoR V酶切后的线性化载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以摩尔数为8∶1比例混和,在重组酶作用下,25℃反应30 min,将PCR产物定向克隆入目标载体pShuttle-IRES-hrGFP-2上,获得阳性重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定。结果:经鉴定,成功构建出重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。结论:无需传统的酶切、连接、载体去磷酸化等手段,利用PCR产物靶向克隆法,可快速、高效完成PCR产物的定向克隆。     

内皮型一氧化氮合酶腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建重组内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达系统载体.方法eNOS的cDNA插入pcDNA3.1(-)中,进行DNA测序、酶切鉴定;插入片段用Xbal和AflⅡ双酶切后连接到pshuttle中,并予酶切鉴定;用P1-see I和I-ceu I双酶切下pshuttle中eNOS的cDNA插入腺病毒载体,通过PCR鉴定.结果正确构建重组eNOS腺病毒表达系统,并被目的基因的PCR鉴定证实.结论重组腺病毒表达载体构建正确,为其在预防经皮腔内动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定基础.     

腺病毒载体的细菌内同源重组系统的建立和初步应用

肿瘤的基因治疗是近年的研究热点。理想的基因治疗应具有目的基因高效性、靶向性转移和可控性表达的特点。目前的关键问题是新型载体的构建。复制缺陷性腺病毒具有感染细胞范围广、滴度高,而且可在细胞周期的任何时段感染的优点,因此被越来越多地应用于基因治疗的研究中。哺乳动物包装细胞293或911内的同源重组是产生重组腺病毒的传统方法,但繁琐、低效,限制了腺病毒载体的更广泛应用。现在已经有一种新的载体系统[1],利用了细菌中高效的同源重组机制代替哺乳动物细胞,同时利用在同源重组时整合入腺病毒骨架中的绿色荧光蛋白(GFP)可以直接…     

内皮型一氧化氮合酶与冠心病的研究进展

冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)是当今严重威胁人类生命健康的主要疾病之一。最近研究显示,内皮功能紊乱是冠心病早期发病的重要机制之一。一氧化氮合酶有三种亚型:神经型、内皮型、诱导型,其中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在冠心病的发生、发展中发挥重要的作用。该文对eNOS的生理作用、机制及其基因治疗与冠心病的关系予以综述。     

内皮一氧化氮合酶胞内定位作用蛋白的研究

内皮细胞一氧化氮合酶活性的调节是一系列影响其转录、翻译和翻译后因素的综合作用过程,其调节机制迄今尚未完全查明。内皮一氧化氮合酶的胞内定位调节是其翻译后调节的重要组成部分。近年来发现的几种蛋白,包括动力蛋白2、一氧化氮合酶相互作用蛋白以及一氧化氮合酶转运诱导蛋白与内皮一氧化氮合酶共存于内皮细胞中,介导一氧化氮合酶的胞内定位,从而影响内皮一氧化氮合酶的活性。     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

细菌内同源重组法构建pAd-EGFP-hSDF-1α腺病毒质粒

目的:利用细菌内同源重组法构建和制备含人基质细胞源衍生因子-1α(hSDF-1α)重组腺病毒质粒。方法:设计5'端分别具有EcoR V/Xho I酶切位点的扩增hSDF-1αcDNA片段上下游引物,聚合酶链反应法(PCR)从pORF-hSDF-1α质粒中扩增hSDF-1α的cDNA,插入pGEM-T Easy载体中,构建pGEM-T-hSDF-1α质粒,EcoR V/Xho I双酶切后回收279 bp片段,与经过相同酶切的8.8 kb pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,连接产物转化感受态DH5α,挑选克隆,重组质粒pShuttle-EGFP-hSDF-1α用EcoR V/Xho I酶切鉴定。pShuttle-EGFP-hSDF-1α经Pm e I酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α;pAd-EGFP-hSDF-1α质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果:线性化的pShuttle-EGFP-hSDF-1α转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183,重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了279 bp的片段。结论:用细菌内同源重组成功地构建了含hSDF-1αcDNA的重组腺病毒质粒,为进行表达hSDF-1α的重组腺病毒的制备及hSDF-1α在骨髓源干细胞动员迁移中的作用研究奠定了基础。     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

细菌内同源重组制备重组腺病毒及其初步应用

目的通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒。方法质粒pAdTrack酶切线性化后，通过电转化方法转化AdEasier细菌，线性化的腺病毒重组质粒转染293包装细胞后获得重组腺病毒，观察腺病毒感染喉癌细胞Hep-2后的报告基因表达情况及病毒对培养细胞生长的影响。结果构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确；扩增的腺病毒转染培养的Hep-2细胞8 h后即开始表达报告基因，48 h后全部细胞均有报告基因表达；该重组的腺病毒对培养Hep-2细胞生长无明显影响。结论通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒，方法简单、成功率高、实验周期短。     

细菌内同源重组构建pAdeasy-1/hp27mt腺病毒质粒

目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含hp2 7mt基因的重组腺病毒质粒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,构成穿梭质粒 pShuttle -CMV/hp2 7mt;然后再用经PmeI酶切的 pshuttle-CMV/hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAdeasy - 1 /hp2 7mt;筛选同源重组质粒阳性克隆 ,提取pAdeasy - 1 /hp2 7mt质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果 :线性化的pShuttle-CMV/hp2 7mt转化含pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,1 2 - 2 0h后获得了30 %阳性重组质粒克隆 ,经酶切获得一大于 2 0kb的大片段和 3 .0kb的特征性片段 ,PCR反应扩增出了 2 75bp的片段 ,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因hp2 7mt。 结论 :用细菌内同源重组法可制备含hp2 7mt的重组腺病毒质粒且经济高效、简便、快捷。为转染 2 93细胞制备高滴度重组腺病毒提供高纯度的重组腺病毒质粒     

β神经生长因子对内皮祖细胞一氧化氮合酶的影响

目的:探讨β-神经生长因子(β-NGF)对大鼠内皮祖细胞(EPCs)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及一氧化氮(NO)合成的影响。方法:将β-NGF重组腺病毒(Ad-β-NGF)及其阴性对照感染至大鼠内皮祖细胞,同时设置空白对照,分别于24h、48h及72h进行检测。用qPCR及Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测不同组eNOS表达情况,硝酸还原酶法测定培养液中NO的水平。结果:Ad-NGF感染组eNOS表达及NO合成明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),并随感染时间的延长而增加。结论:β-NGF能促进内皮祖细胞eNOS表达及NO合成,有利于内皮祖细胞发挥功能。     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。     

Vasostatin重组腺病毒的构建和体外表达的研究

目的构建vasostatin重组腺病毒表达载体,并进行体外表达研究。方法根据GenBank中提供的钙网蛋白序列,设计并合成引物,以人骨骼肌cDNA文库为模板用PCR扩增出人vasostatin基因,将其克隆入T载体。经酶切及测序鉴定后亚克隆至穿梭载体,与经过限制酶处理的骨架腺病毒载体DNA—TPC复合物共转染293细胞。用Western blot检测体外表达。结果PCR扩增出约590bp产物,测序结果与文献报道一致。用PCR及Western blot证实重组腺病毒构建成功,能有效的表达出vasostatin蛋白。结论vasostatin重组腺病毒载体能有效的在体外表达出vasostatin蛋白。     

化浊通脉散对颈动脉粥样硬化家兔凝血机制变化和eNOS表达的影响

目的研究化浊通脉散对颈动脉粥样硬化家兔凝血机制变化及动脉血管内皮的影响,并对其发生机制进行初步探讨。方法 40只新西兰大耳白兔采用高脂饮食的实验方法建立动脉粥样硬化模型,随机分为4组:化浊通脉散组、阿司匹林组、高脂饮食组、空白对照组。各组分别测定药物干预前后血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆纤维蛋白原(Fg)、血浆凝血酶时间(TT)水平。实验结束后应用免疫组织化学方法观察内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)的表达。结果化浊通脉散有延长PT、APTT、TT时间及降低Fg含量的作用(P0.01),并可提高颈动脉粥样硬化血管内膜eNOS的表达。结论化浊通脉散具有抗凝及降纤作用,并可以使血管内膜eNOS活性增强,因此可能具有保护动脉血管内膜,延缓动脉粥样硬化形成的作用。