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相似文献
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1.
目的探讨转染生肌调节因子(myoblast determination,MyoD)基因和连接蛋白43(Connexin,Cx43)基因的大鼠真皮成纤维细胞(dermal fibroblast,DFs)生物学功能的变化及MyoD和Cx43基因转染DFs细胞治疗心力衰竭的可行性。方法采用Gateway技术,构建真核质粒表达载体。利用慢病毒(LV)表达系统,将大鼠MyoD cDNA和Cx43 cDNA转入大鼠成纤维细胞中,经Blasticidin筛选培养,通过RT-PCR,Western印迹法等方法检测MyoD及Cx43蛋白及mRNA表达情况,并且通过显微镜观察转染后生长情况,膜片钳技术检测离子电流变化。结果RT-PCR,Western印迹法检测出MyoD及Cx43蛋白及相应mRNA表达,膜片钳检测到转染后钙离子电流,显微镜观察到基因转染筛选后培养1w细胞的融合现象,并有多核肌管形成。结论MyoD和Cx43基因转染使DFs分化为成肌细胞,为进一步研究基因治疗心力衰竭奠定基础。  相似文献   

2.
大鼠心肌成纤维细胞体外培养的生物学特性及转基因研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的观察大鼠心肌成纤维细胞(CFs)体外培养的生长增殖情况及肌肉转录调节因子(MyoD)基因转染对其生物学特性的影响。方法采用改良的差速贴壁法培养大鼠CFs,利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6/V5-DEST-MyoD转导培养的大鼠CFs,用稻瘟菌素筛选2周,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及细胞免疫化学鉴定。结果成功建立高纯度大鼠CFs的细胞培养模型,且具有良好的细胞形态、正常的生长增殖等生物学功能。转染细胞的MyoD cDNA基因表达阳性,其下游抗α-肌动蛋白(α-actin)呈阳性表达,胞质呈棕黄色,并且含有与细胞纵轴平行排列的肌丝,细胞核用苏木素复染后呈淡蓝色。在2.0×10~5/mL细胞密度的CFs接受转MyoD基因后,抗α-actin阳性率为(27.04±9.41)%。结论真核表达载体成功介导MyoD cDNA转导入体外培养的大鼠CFs,诱导其转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞,CFs可成为心血管疾病基因治疗的靶细胞。  相似文献   

3.
目的:探讨MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的可能性。方法:将MyoD基因重组腺病毒载体转染大鼠心脏成纤维细胞,观察转染后大鼠心脏成纤维细胞形态的变化;用RT-PCR和Western blot方法检测MyoD和肌细胞生成素的表达;免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白的表达。结果:MyoD基因转染后的大鼠心脏成纤维细胞形态和排列方式发生明显变化;RT-PCR可检测出转染后细胞表达MyoD;Western blot结果表明转染后细胞表达MyoD和肌细胞生成素;免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白表达均为阳性。结论:MyoD基因可诱导体外培养的大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞,为进一步研究MyoD对心肌损伤的修复作用奠定了基础。  相似文献   

4.
MyoD基因诱导大鼠成纤维细胞转化为成肌细胞的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的探讨MyoD在体外诱导大鼠成纤维细胞分化为成肌细胞中的作用。方法将大鼠成纤维细胞分成2组:未转染组(N组)和MyoD基因转染组(M组);利用慢病毒表达系统,将大鼠MyoD基因转入大鼠成纤维细胞中,Blasticidin筛选;用RT-PCR和Western blot检测MyoD的表达;免疫组织化学检测MyoD、desmin及-αactin的表达;电子显微镜观察转染前后细胞形态的变化。结果RT-PCR和Western blot可检测出MyoD基因转染后细胞表达MyoD mRNA及蛋白质;免疫细胞化学检测MyoD表达在基因转染的细胞中为阳性,desmin、α-actin阳性表达只出现在M组;电子显微镜观察转染后的细胞胞浆中有微丝以及微管等结构。结论MyoD基因可诱导大鼠成纤维细胞分化成的细胞具有成肌细胞特征,为进一步研究MyoD基因诱导的成肌细胞及在大鼠心梗损伤修复中的作用提供了实验基础。  相似文献   

5.
目的将生肌调节因子(MyoD)基因和间隙连接蛋白43(Cx43)基因体外转染真皮成纤维细胞(DFs)后,自体移植到大鼠心肌梗死区内,观察其在宿主体内生长、增殖情况及对心肌结构和心功能的影响。方法选取急性心肌梗死(AuI)模型制备成功的50只SD大鼠随机分入AMI对照组、DFs移植组、Cx43移植组、MyoD移植组和MyoD/Cx43移植组(n=10)。4周后进行细胞移植实验:①AMI对照组:取100μL细胞培养液基质植入到梗死心肌瘢痕组织中;②DFs移植组:在梗死心肌瘢痕组织中植入100μL用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记未经基因转染的DFs细胞悬液;③Cx43移植组:在梗死心肌瘢痕组织中植入100μL用BrdU标记经Cx43基因转染DFs(Cx43-DFs)的细胞悬液;④MyoD移植组:在梗死心肌瘢痕组织中植入100μL用BrdU标记经MyoD基因转染DFs (MyoD-DFs)的细胞悬液;⑤MyoD/Cx43移植组:在梗死心肌瘢痕组织中植入100μL用BrdU标记经MyoD和Cx43基因联合转染DFs(MyoD/Cx43-DFs)的细胞悬液,以上各组移植细胞密度均为2.0×106/mL。另选假手术组8只仅开胸而不缝扎,不作任何注射,作为正常对照组。在细胞移植前和移植后4周内观察心电图(ECG)和血浆脑钠素(BNP)浓度的变化;于移植4周后采用Langendorff离体心脏灌流和多外围设备转接器(MPA)信号采集分析系统评价大鼠左心室功能;染色法测定心肌梗死面积(MIS);应用免疫组化技术检测BrdU标记移植细胞存在及connexin43蛋白分布的情况;并通过透射电子显微镜观察移植区细胞的超微结构和缝隙连接形成情况。结果细胞移植术后,AMI对照组死亡2只、DFs移植组死亡1只、Cx43移植组死亡1只、MyoD移植组死亡2只、MyoD/Cx43移植组死亡1只,最终进入结果分析确定为每组8只。细胞移植术后4周, MyoD/Cx43移植组MIS为(25.05±4.44)%,低于MyoD移植组的(34.65±4.55)%、Cx43移植组的(41.92±6.64)%及DFs移植组的(42.61±4.17)%。MyoD/Cx43-DFs心肌移植可改善AMI大鼠的心功能,在降低血浆BNP浓度的同时,改善心电图异常程度,MyoD/Cx43移植组大鼠ECG II导联监测可观察到ORS波变窄、R波相对升高及ST段回到基线。Langendorff离体心脏灌流及MPA信号采集分析系统检测心功能显示:MyoD/Cx43移植组左心室最高收缩压(LVPSP)、左心室内压力上升的最大变化速率( dp/dtmax)均高于MyoD移植组、Cx43移植组及DFs移植组[ LVPSP: (14.32±1.10)、(12.76±0.49)、(11.43±0.84)、(11.23±0.83)kPa]: dp/dtmax: (673.83±15.23)、(579.53±13.02)、(462.12±11.76)、(466.81±14.58)kPa],左心室内压力下降的最大变化速率(-dp/dtmax)低于MyoD移植组、Cx43移植组及DFs移植组[ (569.44±15.78)、(504.99±15.41)、(361.72±12.34)、(367.03±9.79)kPa/s],左心室舒张末期压(LVEDP)也呈现低于MyoD移植组、Cx43移植组及DFs移植组[(0.28±0.12)、(0.28±0.13)kPa比(1.29±0.18)、(1.40±0.29) kPa]的趋势。免疫组化检测结果显示心肌瘢痕区边缘有BrdU阳性细胞存在和connexin43蛋白分布;电子显微镜观察在MyoD/Cx43移植组可见心肌移植区细胞间有缝隙连接形成。结论MyoD和Cx43基因联合转染DFs后自体心肌移植能够在宿主体内生长、增殖,并可在一定程度上减轻心肌梗死大鼠左室重构的进程、改善心功能,且这种经心外膜途径移植是安全可行的,为AMI的治疗提供一条行之有效的新途径。  相似文献   

6.
目的:将缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因转染体外培养大鼠骨骼肌细胞,观察转染后细胞上清液中VEGF蛋白的表达及其对血管内皮细胞增殖的影响。方法:利用机械和酶消化法分离培养大鼠骨骼肌细胞,贴块法培养血管内皮细胞;用阳离子脂质体介导pHOX/HIF-1α质粒转染骨骼肌细胞,ELISA法检测转染后VEGF蛋白的分泌情况,MTT法检测其对血管内皮细胞增殖的影响。结果:成功将HIF-1α基因转染大鼠骨骼肌细胞,转染组细胞培养上清中24、48、72和96h检测到VEGF含量分别为(1308.40±102.00)、(1449.20±69.86)、(1802.30±96.71)和(1494.95±86.24)pg/ml,明显高于对照组;转染后骨骼肌细胞分泌的VEGF对血管内皮细胞有显著的促增殖作用。结论:HIF-1α基因转染大鼠的骨骼肌细胞后可增加具有正常功能的VEGF蛋白的分泌,促进血管内皮细胞的增殖。  相似文献   

7.
目的 研究成肌性标志物在人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)分化为肌细胞过程中的表达情况.方法 体外培养hBM-MSCs,采用免疫荧光法和RT-PCR检测hBM-MSCs中成肌性标志物MyoD、myogenin及desmin的表达.将1×107个hBM-MSCs经尾静脉注入免疫抑制的mdx小鼠体内,于移植后2~24周处死,采用免疫荧光法和RT-PCR检测小鼠骨骼肌内MyoD、myogenin、desmin和人特异性抗肌萎缩蛋白(Dys)的表达. 结果每100个hBM-MSCs中MyoD、myogenin和desmin阳性细胞数分别为23.5±5.3、30.7±6.2和28.4±5.7,第5代hBM-MSCs中可检测到MyoD、myogenin和desmin mRNA表达.hBM-MSCs移植后2周,mdx小鼠骨骼肌内可检测到少量MyoD和myogenin阳性细胞,4周后可检测到少量desmin阳性细胞.hBM-MSCs移植后2~4周,骨骼肌中开始出现MyoD和myogenin mRNA表达,12~16周较强;移植后8周开始出现desmin mRNA表达,16周后表达渐增强.hBM-MSCs移植后4周,mdx小鼠骨骼肌肌膜可见少量人特异性Dys阳性细胞,8周后开始出现Dys mRNA表达,随着移植后时间延长,Dys表达逐渐增强. 结论 hBM-MSCs具有向骨骼肌细胞分化的潜力,能在受体内分化为骨骼肌细胞.在hBM-MSCs分化为肌细胞的过程中,MyoD和myogenin表达上调可能发挥了重要作用.  相似文献   

8.
目的:研究原代骨骼肌细胞中瘦素受体长胞内段mRNA表达增加对葡萄糖氧化的影响。方法:RT-RCR扩增瘦素受体长胞内段cDNA,将扩增产物插入真核表达质粒,构建重组体,重组表达质粒经脂质体介导转染原代骨骼肌细胞,转染后48h加瘦素和D-[U-^14C]葡萄糖,收集^14CO2,液体闪烁检测其放射性。另经RT-PCR半定量方法检测瘦素受体长胞内段mRNA在骨骼肌细胞的表达。结果:扩增的瘦素受体长胞内段cDNA及其重组体在限制性内切酶酶切后所得各片段大小均与理论值一致。在重组表达质粒转染组,空带积分光密度比值较后两者升高(均P<0.05);但3组细胞间葡萄糖氧化差异无显著性。结论:成功构建含有瘦素受体长胞内段cDNA的重组真核表达质粒。单纯增加瘦素受体长胞内段mRNA表达不能改善瘦素对骨骼肌细胞的葡萄糖氧化作用。  相似文献   

9.
目的:构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体,并观察外源性Id2基因C2C12细胞中的表达。方法:RT-PCR扩增出Id2全长cDNA,T4DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2cDNA进行连接,构建克隆载体,经限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGFP-C2真核表达载体,构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2,经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性;通过电穿孔转染法将外源性Id2基因导入C2C12成肌细胞中。分别于转染4、8、12、24、36、72h后通过荧光倒置显微镜下观察细胞整体情况,并计算转染效率。结果:经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向I(12cDNA片段,获得高转染率和高表达外源性Id2基因的C2C12细胞,转染8h时,转染效率约为(10.5±2.8)%;转染12h后,转染效率约为(20.9±3.1)%;转染24h后,转染效率最高,约为(60.8±3.2)%。结论:成功构建了同时携带有G418筛选位点和Id2基因的真核表达载体;并获得高表达外源性Id2基因的C2C12细胞。  相似文献   

10.
目的采用组织块培养技术探索大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养方法。方法以成年SPF级Sprague-Dawley大鼠为研究对象,采用组织块培养法获取大鼠骨骼肌卫星细胞,并与C2C12成肌细胞进行比较,对两种细胞进行形态学研究及采用免疫荧光和免疫组织化学法测定两种细胞α-actin蛋白和Desmin蛋白的表达及分布,从而对骨骼肌卫星细胞进行鉴定。结果通过组织块培养法获取的细胞增殖旺盛,分化良好。免疫细胞荧光和免疫组织化学实验结果显示,α-actin蛋白和Desmin蛋白在两种细胞胞浆中均有分布。结论用组织块培养法获取的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌卫星细胞。  相似文献   

11.
目的 研究人体骨骼肌失神经支配后成肌调节因子MyoD和Myf 5蛋白的表达变化 ,了解骨骼肌的再生状态。方法  2 0例不同时间人体失神经骨骼肌与 3例正常骨骼肌标本 ,HE染色和透射电镜观察肌卫星细胞形态变化 ;抗MyoD和Myf 5多克隆抗体免疫组织化学染色 (ABC法 ) ,统计阳性染色细胞核数。 结果 抗MyoD和Myf 5抗体阳性染色细胞核数在人体骨骼肌失神经 1~ 2月时的肌卫星细胞中最多 ;3个月后急剧下降 ,并维持在一低水平 ;1年后几乎无表达。结论 人体骨骼肌失神经支配后早期肌卫星细胞通过MyoD和 (或 )Myf 5途径激活、开始增殖分化并被耗竭  相似文献   

12.
Fang-1,一个参与血糖调节的新基因   总被引:2,自引:1,他引:1  
目的克隆血糖调节相关基因。方法按本室以往建立的方法制备大鼠血糖自动调节模型,以灌输生理盐水为对照;取其骨骼肌,采用差异显示技术(DDRT-PCR),获得差异表达基因片段,经狭缝杂交和Northern杂交分析,排除假阳性片段,确定真正的差异表达序列标签(EST),并以其为探针筛选大鼠骨骼肌cDNA文库;将新基因的全长编码区克隆到pEGFP,瞬时转染L-6TG细胞48h后,荧光显微镜观察蛋白质在细胞中定位。结果获得一个新的全长cDNA,命名为Fang-1,GenBank收录号为AF399873。Blast软件(NCBI)分析显示Fang-1是人类基因AK001644在大鼠中的同源物,其编码区核苷酸同源性为82%,表明该家族蛋白具有保守性。高浓度葡萄糖刺激大鼠后与对照大鼠相比,Fang-1的表达上调;Fang-1编码的蛋白质在细胞核和细胞质均存在。结论从大鼠骨骼肌中克隆到一个参与血糖调节的新基因,该基因编码蛋白在细胞质和细胞核均存在,并通过其表达上调控制或部分控制某些目前未知的机制而达到调节血糖水平的作用。  相似文献   

13.
目的:研究重组腺病毒(Ad)对骨髓基质干细胞(MSCs)的转染,以及绿色荧光蛋白(GFP)和成肌调节因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表达. 方法:用差速贴壁法体外培养大鼠MSCs,并用流式细胞仪(FCM)检测其表面标志;对构建有绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-GFP)进行扩增和鉴定,并转染MSCs;用RT-PCR检测MyoD和Myogenin在转染后MSCs中的表达;将MSCs与C2C12成肌细胞共培养,诱导前者的分化,并用免疫荧光检测MyoD的表达. 结果:FCM检测证实,在MSCs的表面标志中CD11b和CD45阴性,而CD29和CD44阳性;随着Ad-GFP感染复数(MOI)的增加,转染效率也相应提高,但在MOI大于100后,MSCs开始出现病变;RT-PCR结果提示MyoD和Myogenin在转染后的MSCs中有表达;免疫荧光检测证实诱导后的MSCs可以表达MyoD蛋白. 结论:MSCs可以被Ad-GFP有效转染而表达GFP;同时内源性成肌调节因子的激活,可以促进MSCs的成肌分化.  相似文献   

14.
目的探讨成肌调节因子MyoD和myogenin在不同月龄DMD模型鼠mdx鼠的表达情况。方法取不同月龄DMD模型鼠mdx鼠以及相应的同龄正常C57鼠的腓肠肌,冰冻切片后用HE染色显示肌肉病理,SABC-DAB染色检测成肌调节因子MyoD和myogenin的表达。结果不同月龄mdx鼠肌肉坏死和再生程度不同,MyoD和myogenin在1月龄mdx鼠表达最强,在13月龄mdx鼠仍有表达,在正常同龄C57鼠不表达。结论MyoD与Myogenin在肌肉损伤后的再生修复过程中起作用,可作为鉴定肌肉前体细胞和反映肌肉再生的指标。  相似文献   

15.
大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desm in呈强阳性表达。体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1~2 d的潜伏期,5~6 d进入平台期。细胞汇合至60%~70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。  相似文献   

16.
Objective To investigate the possibility of heterologous expression for apoAI, apoE and LCAT by skeletal muscle cells and secretion into blood and to develop a safe and convenient gene therapy method for atherosclerosis. Methods Viral and nonviral vectors containing apoAI, apoE or LCAT genes were constructed and transfected into myogenic cells in vitro or injected directed into mouse skeletal muscle. The expression efficiencies of these vectors were investigated by ELISA assay for human apoAI and apoE3 and by the proteoliposome method for human LCAT. Genomic DNA was extracted from stable transduced myoblasts and analyzed for the presence of vector sequence by PCR amplifications. Immunocytochemistry assay was also performed to make an intuitionistic detection for the expression of transgene in myoblasts. Results All viral or nonviral vectors constructed in present study expressed the transgenes efficiently in mice skeletal muscles in vivo or cultured myoblasts in vitro. The transgene expression level of cells transfected with AAV-based plasmid vectors were 2-4 times higher then that of cells transfected with conventional plasmid vectors. Additionally, cells transfected with AAV-based bicistronic vector or tricistronic retroviral vector expressed both human apoAI and LCAT simultaneously. The sequences of retroviral or AAV-based plasmid vectors were found to be retained in host cells after transfection when that of conventional plasmid vectors were lost. Furthermore, transduced myoblasts maintained the ability for heterologous expression of human apoAI and LCAT even after differentiation into myotubes. For cells transfected with retroviral vectors, stable transduced clones can be selected by G418 and continued to efficiently express human apoAI and LCAT for 3 months. Conclusion These finds indicated that mice skeletal muscles or cultured myoblasts transduced with viral or non-viral vectors could efficiently express and secret human apoAI, apoE and LCAT. It suggested that the use of nonviral, adenoviral or AAV-based vectors to directly inject into skeletal muscle or the use of polycistronic retroviral to genetically modify myoblasts ex vivo and then implantation back to skeletal muscle to high efficiently and long-term express apoAI, apoE and LCAT in vivo might be a safe and feasible strategy to prevent or reduce the formation of atherosclerotic lesions.  相似文献   

17.
病毒载体介导BDNF基因表达在大鼠神经元AD模型中的作用   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 探讨重组腺伴随病毒(rAAV)载体介导表达人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因以及表达的hBDNF对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的AD模型神经元保护效应的机制。方法 使用分子克隆技术克隆了hBDNF基因,并且构建了携带hBDNF基因的rAAV病毒载体(AAV-hBDNF),使用病毒载体转染Aβ诱导损伤的海马神经元。使用MTT检测和流式细胞仪分析观察细胞凋亡变化,同时使用免疫细胞化学技术检测了BDNF蛋白以及Bcl-2抗凋亡蛋白的表达,使用激光共聚焦显微镜观察细胞内游离钙离子浓度([Ca^2+])i的变化。结果 结果显示重组病毒对培养的海马神经元进行了有效的转染,BDNF蛋白表达水平明显增高,表达的BDNF对Aβ诱导的神经元损伤有显著的保护效应,在BDNF治疗组表现出抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增高和有效地维持了[Ca^2+]i平衡。结论 表达的BDNF通过抑制Aβ依赖的细胞内钙超载和增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,有效地保护神经元抵抗Aβ神经毒性引起的凋亡。  相似文献   

18.
目的构建人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)基因真核表达载体,并在无内源性IAPP表达的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株上进行体外表达实验,建立可产生hIAPP沉淀的细胞模型。方法应用RT-PCR技术扩增得到hIAPP cDNA,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1( )-IAPP;随后用lipofectamine 2000介导转染CHO细胞,以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达,以Thiaflavin S染色的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果构建的pcDNA 3.1-hIAPP真核表达体系成功转染体外培养的CHO细胞,目的基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,转染后培养48 h内的CHO细胞用Thioflavin S染色,与阴性对照相比较,证实有hIAPP的表达而导致细胞内淀粉样沉积发生。结论构建了hIAPP真核表达质粒,并成功在体外表达,从而建立了可产生IAPP淀粉样沉淀的体外哺乳动物细胞模型,为进一步研究胰岛淀粉样沉积的发病机制提供了良好的平台。  相似文献   

19.
Atherosclerosisanditsconsequencesaccountformostmorbidityandmortalityintheworld.Anumberofepidemiologicalstudieshavedemon stratedaninverserelationshipbetween plasmahigh densitylipoprotein (HDL)concentrationandtheincidenceofatherosclerosis[1 ] .Itiswidelyac ce…  相似文献   

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