CaMK Ⅱ途径在慢性心衰模型触发性心律失常产生中的作用

目的研究异丙肾上腺素和高频率刺激对心衰心肌细胞晚发后除极(DADs)产生的影响以及钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)途径在DADs产生中的作用。方法制备家兔慢性心衰模型,酶解法分离心室肌细胞,将细胞分为正常对照组(Ctl组)、正常对照+异丙肾上腺素干预组(Ctl+ISO组)、慢性心衰组(CHF组)、慢性心衰+异丙肾上腺素干预组(CHF+ISO组)、慢性心衰+异丙肾上腺素干预+KN93干预组(KN93组)。应用全细胞膜片钳技术记录动作电位(AP),采用含1μmol/L异丙肾上腺素的正钙蒂罗德液灌流心室肌细胞,在1～2Hz电刺激下,诱发心肌细胞产生DADs。在此基础上用KN93(1μmol/L)灌流心衰心肌细胞,观察CaMKⅡ的特异抑制剂KN93对DADs发生率、DADs的幅值、联律间期和发生个数的影响。结果灌流正钙蒂罗德液,并在1Hz电刺激下,Ctl组、Ctl+ISO组、CHF组、CHF+ISO组的DADs发生率分别为15.0%(3/20)、45.0%(9/20)、26.7%(12/45)、92.3%(36/39)。以含1μmol/L异丙肾上腺素和1μmol/L KN93的蒂罗德液灌流心衰心肌细胞,在1Hz电刺激下,KN93组的DADs诱发率为50%(7/14);再给予2Hz的刺激,记录到DADs的幅值为(1.82±0.78)mV、联律间期为(524.62±390.91)ms、个数为(2.42±0.90)。结论异丙肾上腺素和高频率刺激均可诱发心衰心肌细胞DADs的产生;模型应激状态下,KN93可以抑制慢性心衰心肌细胞DADs,CaMKⅡ信号转导途径可能是慢性心衰触发性心律失常产生的重要途径。     

Ryanodine受体Ser2815位点磷酸化状态的改变在心肌肥厚兔触发性室性心律失常中的作用

目的 研究Ryanodine受体Ser2815位点磷酸化状态的改变在心肌肥厚兔触发性室性心律失常中的作用.方法 将30只日本长耳兔随机分为3组:假手术组(Sham组)、心肌肥厚组(LVH组)、心肌肥厚+KN-93组(KN-93组),LVH组和KN-93组均通过缩窄腹主动脉建立兔心肌肥厚模型,Sham组仅游离腹主动脉不进行缩窄.8周后行超声心动图证实心肌肥厚形成,制备兔左室楔形心肌块的灌流模型,同步记录心内、外膜动作电位及跨壁心电图.KN-93组预先给予KN-93预灌,然后观察各组在异丙肾上腺素(1 μmol/L)灌流和快频率程序刺激下触发活动和室性心动过速的发生率.灌流完毕后取左室心肌组织,应用Western blot检测各组心肌Ryanodine受体总量及其Ser2815位点磷酸化蛋白水平.结果 Sham组、LVH组和KN-93组触发活动的发生率分别为0/10、10/10、4/10,室性心动过速或室颤的发生率分别为0/10、9/10、3/10,KN-93组均较LVH组明显降低(均P＜0.05);LVH组Ryanodine受体总量及Ser2815位点磷酸化蛋白水平较Sham组增加(均P＜0.05),KN-93组Ser2815位点磷酸化蛋白水平较LVH组减少(P＜0.05).结论 KN-93可通过降低Ryanodine受体Ser2815位点的磷酸化水平抑制肥厚心肌的室性心律失常,Ryanodine受体的过度磷酸化是触发性心律失常发生的重要机制之一.     

钙调蛋白激酶Ⅱ抑制剂抗肥厚心肌室性心律失常发生机制的研究

目的探讨钙调蛋白激酶Ⅱ特异性抑制剂KN-93抗肥厚心肌室性心律失常发生的机制。方法雌性新西兰大白兔随机分为4组：假手术组（sham组）、心肌肥厚组（LVH组）、心肌肥厚＋KN-93组（KN-93组）、心肌肥厚＋KN-92组（KN-92组），每组14只。LVH组、KN-93组及KN-92组通过缩窄腹主动脉制备兔心肌肥厚模型。8周后，制备兔左室楔形心肌块的灌注模型，同步记录心内、外膜动作电位及跨壁心电图，观察低钾（2mmol／L）、低镁（0．25mmol／L）蒂罗德液灌流及慢频率（2000～4000ms）刺激条件下各组早期后除极（EAD）和尖端扭转型室性心动过速（Tdp）的发生率。采用胶原酶消化法分离单个心肌细胞，应用膜片钳技术记录动作电位（AP），观察低钾、低镁蒂罗德液灌流及慢频率（0.25～0.5Hz）刺激条件下，各组EAD的发生率。结果在低钾、低镁蒂罗德液灌流及慢频率刺激条件下，兔左室楔形心肌块水平，sham组、LVH组、KN-92组（0.5μmol／L）及KN-93组（0．5μmol／L）EAD的发生率分别为0／10、10／10、9／10和5／10，Tdp的发生率分别为0／10、5／10、4／10和1／10。单个心肌细胞水平，Sham组、LVH组、KN-92组（0．5μmol／L）及KN-93组（0.5μmol／L）EAD的发生率分别为0／12、11／12、10／12和5／12。结论钙调蛋白激酶Ⅱ介导心肌肥厚兔室性心律失常的发生，其主要作用机制是通过增加EAD的发生率，从而触发室性心律失常的发生。     

ISO通过CaMKⅡ和PKA激活RyR2诱发心肌细胞凋亡

目的：探讨异丙肾上腺素（ISO）持续激活Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）和蛋白激酶A (PKA)后对心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：将H9C2心肌细胞分为Control组、ISO组、ISO+KN93 (CaMKⅡ抑制剂)组、ISO+H-89 (PKA抑制剂)组，经不同药物干预后，通过CCK-8法检测心肌细胞活力，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒和流式细胞术检测心肌细胞凋亡，Western blot法检测CaMKⅡ、PKA、兰尼碱受体2 (RyR2)及凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2的表达情况，荧光显微镜观察细胞形态变化和钙荧光强度。结果：与Control组比较，ISO组细胞活性降低，CaMKⅡ、PKA和RyR2的磷酸化水平增加，凋亡蛋白Cleaved-Caspase3、Bax/Bcl-2表达增加，胞内钙含量增多，细胞凋亡率增多，差异均有统计学意义（P<0.01）；与ISO组比较，ISO+KN93和ISO+H-89组细胞活性增高，CaMKⅡ、PKA和RyR2的磷酸化水平降低，凋亡蛋白Cleaved-Caspase...     

儿茶酚胺敏感性室性心动过速附1例

本文报告一例患者有儿茶酚胺敏感性室性心动过速的患者，其以运动试验或静脉滴注异丙肾上腺素诱发室速为本病诊断的可靠依据，β－受体阻滞剂对本病具有良好的疗效。     

硫化氢对异丙肾上腺素所致早后除极和触发活动的影响

目的探索硫化氢对异丙肾上腺素所致豚鼠乳头肌早后除极及触发活动的影响。方法应用细胞内玻璃微电极技术记录豚鼠乳头肌动作电位,用异丙肾上腺素诱发早后除极和触发活动,观察硫化氢对早后除极和触发活动的影响。结果 1)含异丙肾上腺素(50 nmol/L)的K-H液灌流可引起豚鼠右心室乳头肌产生早后除极并出现触发活动,有时触发活动会出现持久的节律性活动。2)NaHS(100、200μmol/L)预处理可显著降低异丙肾上腺素诱发的早后除极波幅及发生率和触发活动的发生率(**P<0.01),NaHS 200μmol/L还明显延长早后除极的潜伏期(*P<0.05)。结论硫化氢抑制异丙肾上腺素所致早后除极及触发活动的发生。     

异丙肾上腺素与阿托品在食管心房调搏中诱发心动过速效果观察

目的观察异丙肾上腺素和阿托品在经食管心房调搏(TEAP)检查中诱发患者心动过速的差异,并分析其相关机制。方法选择疑似为阵发性室上性心动过速(PSVT)患者420例为研究对象,根据诱发药物分为异丙肾上腺素组(n=240)和阿托品组(n=180)。2组患者均行TEAP检查以诱发PSVT(基础诱发),基础诱发未成功者分别给予异丙肾上腺素和阿托品进行诱发,比较2组患者给药后TEAP对PSVT的诱发成功率、诱发方式及诱发PSVT类型。结果给药后异丙肾上腺素组和阿托品组患者PSVT诱发成功率分别为54. 59%(101/185)、44. 20%(61/138);异丙肾上腺素组患者PSVT诱发成功率显著高于阿托品组(χ2=10. 230,P <0. 05)。异丙肾上腺素组患者中,S1S1和S1S2诱发例数分别为64例(63. 37%)和37例(36. 63%);阿托品组患者中,S1S1和S1S2诱发例数分别为38例(62. 30%)和23例(37. 70%); 2组患者S1S1和S1S2诱发例数比较差异均无统计学意义(χ2=0. 256、1. 047,P> 0. 05); 2组患者采用S1S1诱发例数均显著高于S1S2诱发例数(χ2=7. 377、8. 619,P <0. 05)。异丙肾上腺素组患者慢快型房室结折返性心动过速(S-F AVNRT)及室性心动过速(VT)诱发率高于阿托品组,房室折返性心动过速(AVRT)及房性心动过速(AT)诱发率低于阿托品组(P <0. 05)。对AVRT亚型进行分析发现,异丙肾上腺素组患者中右侧旁路参与的房室折返性心动过速(OAVRT-R)诱发率高于阿托品组,左侧旁路参与的房室折返性心动过速(OAVRT-L)诱发率低于阿托品组(P <0. 05); 2组患者逆向型房室折返性心动过速(A-AVRT)诱发率比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论异丙肾上腺素与阿托品均可提高心动过速的诱发率,但诱发的PSVT类型有所不同,此差异与2种药物作用机制的不同有关。     

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂对新生大鼠心房肌细胞钙超载的干预作用

目的 观察钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, CaMK Ⅱ)抑制剂KN93对新生大鼠心房肌细胞钙负荷的影响,并对细胞CaMK Ⅱ的表达变化进行检测. 方法 新生大鼠心房肌细胞原代培养96 h,应用钙离子导入剂ionomycin(1.0 μmol/L)建立心房肌细胞钙超载模型,并在KN93 3种浓度(0.25、0.5、1.0 μmol/L)的干预下,以钙离子指示剂Fluo-3 /AM负载心房肌细胞,激光共聚焦显微镜观察心房肌细胞内游离钙的变化;应用Western blot法检测CaMK Ⅱ表达的变化. 结果 ①细胞培养至第4天,免疫组织化学染色90%以上细胞α-肌动蛋白抗体阳性.②与对照组比较,钙离子导入剂ionomycin明显增加细胞内钙离子荧光值[(660.16±108.47) vs (376.12±57.57),P＜0.01];KN93对细胞内钙离子荧光值无明显影响(P＞0.05).③预先加入3种不同浓度KN93可显著降低ionomycin导致的细胞内钙离子荧光强度的增加幅度(P<0.01),与对照组比较差异也有统计学意义(P＜0.01).④钙超载组细胞CaMK Ⅱ表达较对照组明显增加(P<0.01);而KN93对细胞CaMK Ⅱ表达影响不明显.⑤不同浓度KN93预处理后,钙超载组细胞CaMK Ⅱ的表达显著降低(P<0.01). 结论 CaMK Ⅱ抑制剂KN93可降低ionomycin引发的大鼠心房肌细胞钙负荷,并下调细胞CaMK Ⅱ表达.     

鞘内注射钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN93对骨癌痛小鼠痛行为的影响

目的 探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在骨癌痛发病机制中的作用.方法 雄性C3H/HeN小鼠40只分为5组:假手对照Sham组(S组n=8),癌痛模型对照Control组(C组n=8)和KN93 Treat组(T1组n=8、T2组n=8、T3组n=8).C组和T组(T1、T2、T3)小鼠左侧股骨远端骨髓腔接种溶于α-MEM的NCTC 2472纤维肉瘤细胞,建立骨癌痛模型;S组小鼠骨髓腔注入不含NCTC 2472细胞的α-MEM.在术后的第14天S组和C组鞘内注射20%DMSO 5μl,T1、T2、T3组分别鞘内注射溶于20%DMSO的KN93 15 nmol/5μl、30nmol/5μl、60nmol/5μl.各组于给药前及给药后的0.5 h、2h、4h、8 h检测小鼠的自发抬足次数、机械性缩足反射阈值(PWMT)和热缩足反射潜伏期(PWTL).结果 鞘内给予KN9315 nmol对骨癌痛小鼠痛行为无影响,鞘内给予KN93 30nmol、60nmol能剂量依赖性减轻小鼠痛行为反应,给药后0.5 h 2组小鼠自发抬足次数[(7.25±1.49)次、(4.12±1.36)次]比C组[(11.62±1.92)次]降低,PWMT[(1.28±0.14)g、(1.75+0.46)g]、PWTL[(14.64±2.12)s、(16.85±1.61)s]比C组[(0.47±0.16)g、(11.32±1.68)s]升高,差异有显著性(P＜0.05).作用2h达到高峰,维持到4h左右,8 h后基本消失.结论 CaMKⅡ在骨癌痛的发病中起重要作用,鞘内注射KN93能够剂量依赖性改善骨癌痛小鼠的痛行为.     

脊髓钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ-NR2B信号通路参与小鼠骨癌痛的形成

目的 探讨鞘内注射钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ( CaMKII)抑制剂KN93对骨癌痛小鼠脊髓NR2B蛋白表达的影响及机制.方法 SPF级雄性C3 H/HeJ小鼠36只,采用随机数字表法分为3组:假手术组(S组n=8)、骨癌痛组(BP组n=8)和KN93组(K组n=20).BP组和K组采用股骨远端骨髓腔注射20μl含NCTC 2472纤维肉瘤细胞的α-MEM的方法制备骨癌痛模型,S组骨髓腔注入不含NCTC 2472细胞的同体积α-MEM.K组于接种肿瘤细胞后14d鞘内注射溶于20％ DMSO的KN93 60 nmol/5μl,BP组和S组鞘内注射20％ DMSO 5μl.分别于肿瘤细胞接种前1d、鞘内注射KN93或溶媒前1 h、注射后1,2,4,24h(T0～5)时各组随机取8只小鼠,采用von Frev丝测定机械痛阈,并于各时点随机取3只小鼠处死取脊髓L3～5节段,采用Western blot法测定NR2B蛋白的表达.结果 与S组[机械痛阈(1.78 ±0.31)g、NR2B(0.33 ±0.04)]相比,除K组T3时机械痛阈差异无统计学意义(P＞0.05)外,BP组[(0.50±0.11)g]和K组[ (0.52 ±0.10)g]机械痛阈均降低(P＜0.05),BP组(1.78±0 34)和K组T2～5[分别为(1.11±0.14)、(0.73±0.03)、(1.11±0 15)、(1.89±0.32)]脊髓组织NR2B蛋白表达均上调(P＜0.05);与BP组相比,K组T2～4机械痛阈升高,NR2B蛋白表达下调;与给药前T1相比,除K组T2～4机械痛阈升高外,各组各时点该指标差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 鞘内注射KN93缓解小鼠骨癌痛的同时降低小鼠脊髓NR2B蛋白表达,CaMKII-NR2B信号通路可能参与了骨癌痛的形成.     

CaMK Ⅱ在小鼠重症急性胰腺炎胰腺损伤中的作用

目的 观察钙调素依赖蛋白激酶（CaMK Ⅱ）在重症急性胰腺炎（SAP）小鼠胰腺组织中的表达情况,并探讨其抑制剂KN93对SAP胰腺损伤的保护作用和机制。方法 36只健康雄性C57小鼠随机分为假手术组、SAP组、KN93组、SAP组+KN93组,9只/组。于造模后24 h收集血清和胰腺组织;采用HE染色观察胰腺组织病理改变;Elisa检测血清脂肪酶、淀粉酶活性以及炎性因子变化情况;免疫印迹法检测CaMK Ⅱ、p-CaMK Ⅱ、p-NF-κB、MAPK、p-MAPK在小鼠胰腺组织中的表达变化。 结果 与假手术组比较,SAP组p-CaMK Ⅱ、p-NF-κB、p-MAPK表达水平升高（P<0.05）。KN93干预后,SAP小鼠胰腺组织病理损伤减轻,血清脂肪酶、淀粉酶以及炎性因子（TNF-α、IL-6）水平降低（P<0.05）,同时NF-κB、ERK和MAPK蛋白磷酸化也降低（P<0.05）。结论 CaMK Ⅱ蛋白在SAP疾病胰腺组织活性升高,CaMK Ⅱ抑制剂KN93能有效减轻SAP小鼠胰腺损伤和炎症程度,其机制可能与ERK/MAPK信号通路有关。     

CaMKⅡ信号通路在神经肽Y诱导心肌细胞肥大中的作用

目的：探讨钙离子／钙调蛋白（Ca^2＋／CaM）依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）信号通路在神经肽Y（NPY）诱导下心肌细胞肥大的作用。方法：原代培养SD乳鼠心肌细胞，将细胞分为5组，NPY组：培养液中加入终浓度为100nmol／L的NPY：KN-931组、KN-935组和KN-9310组除加入100nmol／L的NPY外，分别加入CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93，终浓度为1μmol／L、5μmol／L和10μmol／L；对照组：培养液中不加任何刺激药品。加药24h后采用 ^3H-亮氨酸（Leu）掺入法测定各组心肌细胞蛋白质合成速率，Western blotting测定对照组与NPY组心肌细胞的CaMKⅡδ蛋白表达。结果：经100nmol／L NPY刺激24h后，可明显增加心肌细胞^3H-Leu掺入量（p〈0．05），KN-93（1-10μmol／L）可以抑制NPY刺激的心肌细胞^3H-Leu掺入量的增加，并呈剂量依赖性（P均〈0．05）；100nmol／L NPY明显增加心肌细胞内CaMKⅡδ蛋白的表达（P〈（0．05）。结论：Ca^2＋／CaM依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）信号途径参与NPY诱导的大鼠心肌细胞肥大反应。     

丹参酮ⅡA对压力超负荷大鼠心肌肥厚及MAPK通路的影响

目的 探讨丹参酮ⅡA对大鼠胸主动脉缩窄诱导的心肌肥厚及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的影响.方法 通过在右无名动脉和左侧颈总动脉之间部分缩窄胸主动脉而诱导大鼠心肌肥厚模型.将制好的模型大鼠随机分成6组:假手术组、胸主动脉缩窄组、胸主动脉缩窄组+低剂量丹参酮组(5 mg/kg)、胸主动脉缩窄组+中剂量丹参酮组(10 mg/kg)、胸主动脉缩窄组+高剂量丹参酮组(20 mg/kg)、胸主动脉缩窄组+缬沙坦组(10 mg/kg).用药8周后,B超检测心肌肥厚程度和心功能的变化;将心肌样本沿横切面切开并做苏木精-伊红染色;Western blot 法分析心肌MAPK信号蛋白表达变化.结果胸主动脉缩窄组相对于假手术组在心脏重量指数、左室重量指数、心肌纤维直径、左心室后壁及室间隔厚度均增加.而丹参酮ⅡA和缬沙坦组均可减轻上述变化的程度.Western blot结果显示:相对假手术组,模型组的p-ERK(磷酸化的细胞外信号调节激酶)和p-p38(磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶)均减少,差异均具有统计学意义(均P＜0.01).相对于模型组,各丹参酮ⅡA和缬沙坦治疗组p-ERK减少,差异均具有统计学意义(均P＜0.05);丹参酮ⅡA高剂量和中剂量组,以及缬沙坦治疗组p-p38增加,差异均具有统计学意义(均P＜0.05).结论 丹参酮ⅡA通过调节MAPK通路中的蛋白表达而发挥其抑制心肌肥厚的作用.     

慢性电刺激对成肌分化的C2C12细胞肌型转换的影响

目的研究钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)在低频复合生理频率慢性电刺激(chronic electrical stimula-tion with lower physiological frequency,CESLPF)对骨骼肌细胞肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)亚型表达的影响。方法以体外2%马血清诱导小鼠成肌母细胞C2C12成肌分化为模型。实验分3组:对照组、CsA组和KN93组。对照组为正常分化的细胞;CsA组和KN93组在细胞诱导分化3 d后,分别用CaN抑制剂环孢菌素A(CsA,8μmol)、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMK)抑制剂KN93(6μmol)单一或联合CESLPF(10+40 Hz,1.5 h/d,共2 d)处理。通过RT-PCR、Western blot检测观察成肌分化过程中肌球蛋白重链亚型的表达水平及其转换情况,采用比色法检测CaN的活性。结果在成功构建的体外成肌分化模型上发现,CsA和KN93能够抑制C2C12细胞MHCⅠ的mRNA及蛋白的表达。与分化对照组MHCⅠmRNA相对表达量(0.79±0.04)相比,CsA组(0.62±0.03)和KN93组(0.69±0.05)能够抑制C2C12细胞MHC I型纤维的表达(与对照组比P<0.05);对照组、CsA和KN93处理组MHC I蛋白相对水平分别是(0.91±0.05)、(0.36±0.01)和(0.66±0.02)。对照组MHCⅡb相对表达量为(0.53±0.01),CsA(0.63±0.02)和KN93(0.75±0.03)促进MHCⅡb型纤维的表达(与对照组比较,P<0.05);CESLPF能够逆转上述改变(与对照组比较,P>0.05)。CsA能够抑制CaN的活性表达;CESLPF能够显著提高CaN活性(P<0.05),但仍显著低于正常水平(P<0.05)。结论 CaN和CaMK是骨骼肌细胞MHCⅡ型向MHCⅠ型转变的重要调控酶,CESLPF可能是经CaN通路和非CaN通路联合作用促进肌型转换,该结果为临床应用CESLPF治疗OSAS提供了实验依据。     

血管紧张素Ⅱ1型受体经蛋白激酶C调节L型钙流

目的　以往的研究表明血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对心室肌细胞L型钙流 (ICa,L)的影响及作用机制尚有争议。本文应用AngⅡ 1型受体 (AT1)阻滞剂Losartan和蛋白激酶C(PKC)抑制剂H 7来研究AngⅡ对单个豚鼠心室肌细胞ICa ,L的作用及机制。方法　应用膜片钳技术研究AngⅡ对单个豚鼠心室肌细胞ICa ,L影响的细胞机制。结果　结果表明 ,在膜片钳全细胞记录模式 ,AngⅡ刺激ICa ,L,呈浓度依赖性 ,最大作用浓度为 10 0nmol/L (n =9)。30nmol/L的AngⅡ使ICa ,L峰电流由 11 3± 0 6pA/pF增大为 15 3± 0 6pA/pF( 10mV ,n =9,P <0 0 5)。 10 0nmol/L的Losartan本身对ICa ,L无影响 ,但可抑制AngⅡ对ICa,L的作用。AngⅡ对ICa,L的作用也能被 2 0nmol/L的H 7所抑制 ,而H 7本身对ICa,L无影响。结论　以上结果提示AngⅡ经AngⅡ 1型受体刺激ICa,L,这一作用经由PKC介导而实现。     

互隔交链孢酚激活EC9706细胞DNA聚合酶β表达的信号通路初探

目的：研究互隔交链孢酚（AOH）对食管癌EC9706细胞株中DNA聚合酶β（DNA pol β）表达的影响．方法：以PKA激活剂Forskolin（40μmol／L）为阳性对照,采用免疫细胞化学,Western Blot方法检测20μmol／LAOH作用EC9706细胞16h后pol β蛋白水平的表达．以PKA特异性抑制剂H89（10μmol/L）预处理EC9706细胞1h,再以20μmol／LAOH作用细胞16h,观察H89阻断AOH激活pol β蛋白表达的作用．结果：免疫细胞化学结果显示,与溶剂对照组和I-189处理组相比较,AOH处理组,Forskolin处理组的细胞中pol β表达增高．Western Blot结果表明,AOH处理组,Forskolin处理组pol β表达分别是溶剂对照组的2．05和3．12倍（P〈0．05）,而H89组仅为对照组的1．32倍．结论：AOH可以激活食管癌EC9706细胞中pol β基因表达,这可能是通过PKA信号转导通路介导的．     

PKA-PINK1/Parkin信号通路在氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠皮质星形胶质细胞凋亡和焦亡中的作用

目的评价蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）-PTEN诱导性激酶蛋白1（PTEN induced putative kinase 1,PINK1） /E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases, Parkin）信号通路在氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠皮质星形胶质细胞凋亡和焦亡中的作用。 方法体外培养SD新生大鼠原代皮质星形胶质细胞,将细胞接种于6孔板或96孔板,根据随机数字表法将星形胶质细胞分为4组（n=42）：对照组（C组）、氧糖剥夺组（oxygen-glucose deprivation,OGD/R组）,H89+氧糖剥夺（H89+OGD/R, HO组）,H89对照组（H组）,H89为PKA特异性抑制剂。采用无糖培养基在无氧条件下（95% N2和5% CO2的混合气体内）孵育6 h,再放置在含有5% CO2的正常环境下培养24 h的方法制备氧糖剥夺/复氧复糖损伤模型,HO组和H组在氧糖剥夺前1 h向培养基内加入H89 10 μmol/L, C组和H组PBS洗涤后置于含有5% CO2的正常培养箱中培养。根据上述各组处理后,采用膜联蛋白（Annexin V）-FITC/碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）免疫荧光双染流式细胞学法测定细胞凋亡率,采用半胱天冬酶-1裂解片段（cleaved caspase-1）/PI免疫荧光双染流式细胞学法测定细胞焦亡率,采用四甲基偶氮唑法测定细胞存活率,采用Fluo-3/AM免疫荧光法测定细胞内钙离子浓度,二氯荧光黄双乙酸盐（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）法测定活性氧（reactive oxygen species, ROS）含量,酶联免疫吸附法检测PKA活性,蛋白免疫印迹法法检测PINK1和Parkin的表达。 结果与C组比较,OGD/R组和HO组皮质星形胶质细胞的凋亡率和焦亡率、细胞内游离钙离子浓度、ROS含量、PKA活性、PINK1和Parkin表达升高,细胞存活率下降（P＜0.05）;与OGD/R组比较,HO组皮质星形胶质细胞的凋亡率和焦亡率、细胞内游离钙离子浓度、ROS含量、PKA活性PINK1和Parkin表达下降,细胞存活率升高（P＜0.05）;C组与H组以上各项指标差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论抑制PKA-PINK/Parkin信号通路过度活化能够减轻氧糖剥夺/复氧复糖后大鼠星形胶质细胞凋亡和焦亡。     

血管紧张素Ⅱ对L6大鼠成肌细胞胰岛素作用机制的研究

目的研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对L6大鼠成肌细胞的胰岛素信号传导的影响,探讨AngⅡ影响胰岛素信号传导通路的可能机制。方法培养及诱导分化IJ6细胞,根据AngⅡ或JAK2-PKA抑制剂H89干预的不同,将其分为4组：对照组、胰岛素组、胰岛素＋AngⅡ组及胰岛素＋AngⅡ＋H89组。采用RT-PCR方法检测IRS1、GLUT4mRNA的表达水平,Westernblot方法检测IRS1、ptyr_IRS1、总蛋白和膜蛋白中GLUT4的蛋白表达。结果RT—PCR检测4组间GLUT4mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）,后3组间IRSImRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）,但均较对照组增加（P〈0．05）。Westernblot检测后3组IRS1、ptyr_IRS1、膜蛋白中GLUT4表达均较对照组升高（P〈0．05）,而3组间IRSl表达差异无统计学意义（P〉0．05）,4组间GLUT4表达差异无统计学意义（P〉0．05）,胰岛素＋Angll＋H89组ptyr_IRSI、GLUT4较胰岛素＋AngⅡ组表达增加（P〈0．05）,较胰岛素组表达减少（P〈0．05）。结论AngⅡ在骨骼肌细胞中通过JAK2-PKA通路抑制IRS1的酪氨酸磷酸化,抑制GLUT4由胞浆转移至胞膜,进而导皲哺岛素括精．