酪氨酸羟化酶重组质粒标准品构建

目的:用T-A克隆法构建含酪氨酸羟化酶(TH)基因的重组质粒,并用实时定量PCR(RQPCR)方法制备标准品。方法:提取小鼠肾上腺髓质组织总RNA,逆转录为cDNA后进行RT-PCR,回收纯化电泳胶,T-A克隆与pGEM-T载体连接,转化Top-10感受态细菌,蓝白斑筛选出阳性菌落后,大量提取质粒,再进行RQPCR反应,最后制得含TH的重组质粒标准品。结果:肾上腺髓质TH的表达,PCR扩增,菌液PCR,测序鉴定均证实TH重组到pGEM-T载体上,经RQPCR定量后得到TH重组质粒标准品的标准曲线。结论:该方法能大量制备TH质粒标准品,并且可推广应用。     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品的构建

目的:构建检测鼻咽癌患者血浆EB病毒(人疱疹病毒4型)DNA的荧光定量PCR标准品. 方法:用EB病毒基因高度保守序列设计特异的引物和荧光探针,常规PCR法扩增目的片段,将纯化的PCR产物与PMD-18T载体进行连接,转化宿主菌DH-5a,然后用PCR初筛和测序分析证实目的片段克隆成功,提取重组质粒DNA,纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定重组质粒拷贝浓度,并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品. 结果:PCR初筛及测序分析均证实EB病毒DNA重组到PMD-18T载体上. 结论:本试验成功克隆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品.     

粪便基因组DNA提取方法比较及在沙门菌定量PCR检测中的应用

目的 建立并优化1种可用于临床微生物检测的粪便微生物基因组DNA提取方法并应用于沙门菌定量PCR快速检测.方法 分别利用土壤微生物基因组DNA提取试剂盒法、微生物基因组DNA提取试剂盒法和本实验室改进酚/氯仿抽提法提取腹泻患者粪便基因组DNA,根据沙门氏菌16srDNA、 dT等基因或DNA功能区序列设计PCR引物,进行多基因定量PCR检测.结果 3种方法提取的基因组DNA均可进行有效的定量PCR扩增,采用所建立的多重PCR方法可特异鉴别粪便沙门氏菌.结论本研究改进的粪便基因组DNA提取方法及临床微生物的定量PCR检测可在较短的时间内实现对大量临床样品快速诊断,有一定应用前景.     

人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光PCR定量标准品的构建

目的构建实时荧光定量PCR(FQPCR)的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原(PSA)mRNA的表达。方法以Trizol裂解抽提法提取LNCaP细胞的总RNA。以RTPCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增;以AT载体克隆法制备重组质粒,并转化E.coliDH5α菌提取重组质粒,联合用氨苄青霉素筛选法和α筛选法、EcoRⅠ限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测λ260nm吸光度,确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

基因重组构建AFP mRNA的real time RT-PCR标准定量模板

目的 :构建AFPmRNA的realtimeRT PCR标准定量模板。方法 :提取肝瘤细胞株BEL740 2细胞总RNA ,进行RT PCR扩增并纯化AFP基因片段 ,与PMD 1 8T载体连接构建重组质粒。结果 :重组质粒的阳性克隆效率为81 .8% ,经酶切鉴定 ,目的基因片段已插入PMD 1 8T载体内。结论 :成功构建了AFPmRNA的标准定量模板 ,可应用于该基因的realtimeRT PCR定量检测     

人肝细胞生长因子mRNA实时荧光PCR定量标准的构建

目的:构建实时荧光定量PCR(FQ-PCR)标准以定量检测人肝细胞生长因子mRNA的表达.方法:采用RT-PCR法利用肝组织提取的总RNA制备肝细胞生长因子cDNA目的片段.与pGEM-TEasy Vector连接成重组质粒并转化E.coli DH5α.联合用直接PCR、α互补和氨苄青霉素筛选法、EcoRI限制性酶切和序列分析法鉴定其特异性.测定纯化的重组质粒A260,确定浓度并以此制备FQ-PCR梯度浓度参考标准.结果:HGF cDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性.结论:成功构建了实时FQ-PCR定量参考标准.     

实时定量PCR评价小鼠胸腺功能方法的建立

目的建立实时定量PCR检测小鼠胸腺及脾脏T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环（sjTRECs）水平的方法。推测其中的初始T细胞的数目，评价胸腺功能，从而为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。方法提取小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞基因组DNA，PCR扩增目的片段。纯化构建标准质粒的RAG2片段，构建标准重组质粒并鉴定。优化PCR体系后，实时定量PCR反应建立标准曲线，并检测不同品系（BALB／c和C57BL／6）成年小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞sjTRECs含量。结果成功构建标准质粒。确定最适实时定量PCR反应条件后，在实时定量PCR中建立可信度高的标准曲线。建立的方法分析表明，这两个不同品系的sjTRECs含量统计学差异不显著。结论成功建立定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量从而推测其中的初始T细胞数目的方法。为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。     

Real time RT-PCR定量检测AFP mRNA表达水平方法的建立

目的　建立realtime逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测AFPmRNA表达水平方法。方法　提取BEL740 2细胞总RNA ,进行RT PCR扩增并纯化AFP基因片段 ,构建重组质粒 ,建立realtimeRT PCR检测AFPmRNA表达水平方法。结果　重组质粒的阳性克隆效率为 81.8% ,经酶切鉴定 ,目的基因片段已插入PMD 18T载体内 ,得到realtimeRT PCR动力学曲线。结论　成功建立了realtimeRT PCR定量检测AFPmRNA表达水平方法。     

人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光POR定量标准品的构建

目的 构建实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原（PSA）mRNA的表达。方法 以Trizol裂解抽提法提取LNcaP细胞的总RNA。以RT-PCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增；以A-T载体克隆法制备重组质粒，并转化EcoliDH5。菌提取重组质粒，联合用氨苄青霉素筛选法和筛选法、EcoRI限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测）．260nm吸光度，确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果 PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒。保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论 成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

中国汉族人群apoBVNTR等位基因的多态性分析及其分型标准物的克隆制备

目的对中国汉族人群的apoB VNTR等位基因进行分布频率、序列结构等多态性分析,并通过分子克隆技术制备apoB VNTR等位基因分型标准物。方法通过PCR扩增并结合电泳、测序等方法分析人群apoB VNTR等位基因的多态性,并将该人群中得到的所有类型等位基因片段插入pUC重组质粒,经转染、扩大培养、扩增及再鉴定后,制备出apoB VNTR等位基因分型标准物。结果所检测人群中共检测出16种apoB VNTR等位基因,发现核心序列存在变异体,并成功制备出分型标准物。结论对apoB VNTR的多态性分析应结合等位基因的分布频率与核心序列的结构,所制备的apoB VNTR等位基因分型标准物使apoB VNTR电泳法分型更加准确。     

Y染色体STR基因座DYS385等位基因分型标准物的制备及群体遗传学研究

目的　采用分子克隆技术大量制备优质标准 STR基因座等位基因分型标准物 ,解决长期困扰STR分型上存在的准确性和标准化问题。方法　先用 PCR扩增出 Y染色体上 DYS385基因座的 9个等位基因片段 ,将其插入 p U C重组质粒中 ,经 DNA测序分析证实插入片段的结构及大小 ,按国际标准将插入的等位基因片段进行命名 ,最后经转染、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出标准的 DYS385等位基因分型标准物。结果　应用此法制备出大量的 DYS385等位基因分型标准物 ,并将其成功地应用于该基因座在中国成都地区汉族及德国美茵茨地区高加索人群体中的基因型分布频率调查。结论　该法制备的 STR基因座等位基因分型标准物在法科学实践中应用价值极高 ,DYS385基因座是一个适合我国群体分析和法科学应用的遗传标记     

Y染色体STR基因座DYS385等位基因分型标准物的制备及群体遗传学研究

目的 采用分子克隆技术大量制备优质标准STR基因座等位基因分型标准物,解决长期困扰STR分型上存在的准确性和标准化问题,方法 先用PCR扩增出Y染色体上DYS385基因座的9个等位基因片段,将其插入pUC重组质粒中,经DNA测序分析证实插入片段的结构及大小,按国际标准将插入的等位基因片段进行命名,最后经转染、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出标准的DYS385等位基因标准物。结果 应用此法制备出大量的DYS385等位基因分型标准物,并将成功地应用于该基因座在中国成都地区汉族及德国美茵茨地区高加索人群体中的基因型分布频率调查。结论 该法制备的STR基因座等位基因分型标准物在法科学实践中应用价值极高,DYS385基因座是一个适合我国群体分析和法科学应用的遗传标记。     

生物素交联补骨脂素标记HPV基因探针的制备

对含ＨＰＶ１６和ＨＰＶ１８ＤＮＡ质粒的大肠杆菌进行培养、扩增，提取大量质粒ＤＮＡ，纯化、酶切、回收ＨＰＶＤＮＡ片段，用国产生物素交联补骨脂素标记，再经纯化鉴定。制备的ＨＰＶＤＮＡ探针用亲合素辣根过氧化物酶显色，敏感性可达ｌｐｇ。检测靶核苷酸的敏感性可达５ｐｇ。该探针用于原位杂交检测１０例食管癌组织及相应癌旁粘膜组织中的ＨＰＶＤＮＡ，也取得良好结果。结果提示：用生物素交联补骨脂素标记基因探针是一种简单的方法，且效果良好，适于研究和临床检测。     

七种常见MBL基因单倍型标准质粒的构建

目的 构建7种常见的MBL基因单倍型标准质粒。方法以已确认MBL基因单倍型及基因型的DNA样本为模板．利用SSP-PCR技术扩增出包含MBL基因启动子区及第一外显子的单倍型片段并将其克隆人T载体；用定点突变技术分别将其第一外显子52和57位密码相应的碱基突变；采用PCR和测序进行鉴定。结果以单倍型及基因型已确认的DNA样本为模板，采用SSP-PCR和分子克隆技术获得单倍型HYPA、LXPA、LYOA、LYPA和LYPB重组质粒；以单倍型HYPA及LYOA重组质粒为模板，采用定点突变技术获得单倍型HYPD及LYOC标准质粒。结论构建成功常见的7种MBL基因单倍型标准质粒，为采用SSP-PCR、Real-time PCR等技术分析MBL基因相应的SNP及其单倍型与基因型提供了标准对照。     

人乳头瘤病毒16型E7基因原核表达载体的构建及表达

目的:构建人乳头瘤病毒16型(HPV-16)E7基因原核表达载体,观察目的基因的蛋白表达.方法:人工合成HPV16 E7基因核苷酸序列,利用特异性引物通过聚合酶链反应扩增HPV16 E7基因,并克隆至pGEX-4T1原核表达载体,构建重组表达载体pGEX-4T1-HPV16-E7.将其转化到工程菌Rosetta后,经I...     

七种常见MBL基因单倍型标准质粒的构建

目的构建7种常见的MBL基因单倍型标准质粒。方法以已确认MBL基因单倍型及基因型的DNA样本为模板,利用SSP-PCR技术扩增出包含MBL基因启动子区及第一外显子的单倍型片段并将其克隆入T载体;用定点突变技术分别将其第一外显子52和57位密码相应的碱基突变;采用PCR和测序进行鉴定。结果以单倍型及基因型已确认的DNA样本为模板,采用SSP-PCR和分子克隆技术获得单倍型HYPA、LXPA、LYQA、LYPA和LYPB重组质粒;以单倍型HYPA及LYQA重组质粒为模板,采用定点突变技术获得单倍型HYPD及LYQC标准质粒。结论构建成功常见的7种MBL基因单倍型标准质粒,为采用SSP-PCR、Real-timePCR等技术分析MBL基因相应的SNP及其单倍型与基因型提供了标准对照。     

7株不同原核质粒表达丙型肝炎核心蛋白的差异研究

目的通过比较不同原核质粒表达丙型肝炎核心蛋白(CORE)的差异,筛选出能高效表达CORE的原核质粒。方法用PCR扩增并获得CORE基因,扩增产物分别构建到7种不同原核表达质粒中,重组质粒用IPTG诱导表达,聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)初步鉴定表达产物,并经Western blot验证。结果 PCR及双酶切验证表明CORE基因成功构建到7种原核质粒中,SDS-PAGE验证各融合质粒表达目的蛋白存在差异,其中pTrc-CKS-CORE及Pmbp-C-CORE可见相应的融合蛋白表达,以pTrc-CKS-CORE表达量高,表达产物经Western blot验证表达成功。结论成功构建7株不同CORE原核表达质粒,各融合质粒表达CORE存在较大差异,筛选出高表达CORE质粒,为下一步研究奠定基础。