革兰阴性菌基因快速失活载体的构建及其应用

目的 构建适用于革兰阴性菌的快速基因失活载体系统并进行初步应用.方法 应用分子克隆技术构建快速基因失活载体系统.载体成分主要包括:π蛋白依赖件复制起点ori R6K;编码接合转移的mob片段;多克隆位点序列;含有2个Xcm Ⅰ酶切位点的T载体形成片段以及多种耐药片段,包括Chl(氯霉素抗性)、Tet(四环素抗性)、Km(卡那霉素抗性),获得的载体分别命名为EK3-Chl、EK3-Tet、EK3-Km.采用构建的EK3-Tet载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行插入突变,以验证其有效性.通过Xcm Ⅰ酶切EK3-Tet质粒形成T载体状态,将PCR扩增得到的两端截短的yeeZ基因与该T载体直接连接,获得的质粒采用接合方式转移到弗氏枸橼酸杆菌ATCCS090中以实现整合,双抗培养基筛选整合突变株,对获得的突变株进行鉴定和形态观察.结果 成功构建了EK3-Chl、EK3-Tet和EK3-Km,并对yeeZ基因进行插入突变获得突变株,步骤简便,工作周期短.结论 上述构建的载体系统能够对革兰阴性菌进行目的 基因的快速插入失活,该载体可在细菌基因功能研究中得到一定的应用.     

副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用

目的 摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义.方法 通过融合PCR技术将目的 基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合转移到副溶血性弧菌菌株内,经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株.结果 成功构建了副溶血性弧菌RIMD2210633菌株ΔopaR,ΔtoxR和ΔaphA三个基因突变株.结论 通过自杀载体同源重组成功获得精确敲除的无痕突变株更有利于基因功能的研究,使后续副溶血性弧菌突变株与野生株的对比研究成为可能.     

弗氏枸橼酸杆菌yeeZ基因突变引起细菌分裂抑制

目的通过确认引起弗氏枸橼酸杆菌分裂抑制的致突变基因yeeZ,了解其与细菌分裂的关系。方法对弗氏枸橼酸杆菌进行广泛的转座突变,筛选菌体变长的突变株,用反向PCR方法对突变株的失活基因进行定位测序;构建自杀载体EK—I质粒并利用单交叉重组机制重新构建yeeZ突变株,观察其生物学特征并与转座突变株比较。结果经基因测序定位确认发生分裂抑制突变的是yeeZ基因,重新构建的yeeZ基因自杀突变株的生物学特征与转座突变株完全一致。结论弗氏枸橡酸杆菌yeeZ基因失活可引起细菌的分裂抑制,即yeeZ基因的功能与细菌分裂有关。     

小鼠MME基因真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆小鼠巨噬细胞金属弹力酶(MME)基因结构域Ⅰ和Ⅱ,构建真核细胞表达载体,用于动物肿瘤原位种植模型的研究.方法通过PCR选择性扩增MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切及PCR鉴定.结果以MME cDNA为模板进行PCR扩增的特异性片段在750 bp和1 000 bp之间.以此构建的pGEM-T-MME克隆载体和表达载体, 经限制性内切酶酶切证实载体中带有MME目的基因片段; 与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%; 证明MME基因已正确克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中.结论成功构建了pcDNA3.1-MME重组质粒,奠定了转基因研究MME表达与肿瘤生长转移关系的实验基础.     

单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株的构建

目的 构建单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株.方法 克隆fbpa及其上、下游基因,构建其载体质粒;通过酶切反应将上、下游基因分别重组到载体质粒中,形成同源重组质粒;同源重组质粒电转入细菌内,进行同源重组;采用PCR、Western blot鉴定敲除菌株.结果 单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株基因组DNA无fbpa基因片段,且无FbpA蛋白表达.结论 成功构建单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株.     

maspin/PCR2.1表达载体的构建及意义

目的:构建maspin/PCR2.1表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法:PCR扩增maspin基因全长,将表达载体PCR2.1用Hind111 XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到人肝癌高转移细胞株MHCC-97中进行表达,检测转染前后maspin表达的变化.结果:重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增;提纯、纯化后,用HindⅢ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到PCR2.1表达载体,并在人肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达.结论:成功构建了maspin/PCR2.1表达载体,能在真核细胞中.     

单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株的构建

 目的构建单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株。方法 克隆fbpa及其上、下游基因,构建其载体质粒;通过酶切反应将上、下游基因分别重组到载体质粒中,形成同源重组质粒;同源重组质粒电转入细菌内,进行同源重组;采用PCR、Western blot鉴定敲除菌株。结果 单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株基因组DNA无fbpa基因片段,且无FbpA蛋白表达。结论 成功构建单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株     

βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立

目的:建立βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型.方法:采用美国iGTL实验室的技术构建打靶载体,建立基因敲除小鼠模型.采用PCR对小鼠基因型进行鉴定,Western印迹法对晶体蛋白的表达进行鉴定.结果:PCR成功检测出3种基因型;纯合子基因敲除的小鼠未检测到βB2晶体蛋白的表达.结论:成功构建了βB2晶体蛋白基因敲除的小鼠模型.     

maspin/pEFIRES-N表达载体的构建及应用

目的构建maspin/pEFIRES-N表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法 PCR扩增maspin基因全长,将表达载体pEFIRES-N用EcoRⅠ XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,稳定转染到肝癌高转移细胞株mHCC-97中进行表达,检测稳定转染前后maspin表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到pEFIRES-N表达载体,并在肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达,抑制了肝癌MHCC-97细胞增殖及浸润.结论成功构建了maspin/pEFIRES-N表达载体,能在真核细胞中表达.     

Ⅰ类整合子在革兰阴性菌中分布的初步探讨

目的 调查Ⅰ类整合子在革兰阴性菌中分布及其与细菌耐药性的关系.方法 用整合子特异引物采用聚合酶链反应（PCR）技术检测革兰阴性菌株中整合子基因.结果 49株临床分离的革兰阴性菌,Ⅰ类整合子阳性者有35株,占71%（35/49）,且35株菌均表现对β-内酰胺类、喹诺酮类等的多重耐药.结论 Ⅰ类整合子在革兰阴性菌中分布较广,并参与细菌耐药性的形成,常引起多重耐药.     

人组织因子基因RNA干扰载体的构建与鉴定

目的 构建人组织因子基因RNA干扰载体,为达到阻止凝血过程的启动打下基础.方法 利用Invitrogen公司在线软件设计人组织因子基因(NM 001993)干扰片段,合成shRNA序列,再制备双链寡核苷酸(ds oligo),退火后形成的ds oligo双链克隆到pENTRTM/U6载体的粘性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒DNA小提、测序.将构建的载体转染到脐静脉内皮细胞,应用RT-PCR和免疫荧光验证载体对目的基因的干扰情况.结果 测序证实阳性克隆为pENTRTM/U6-TF-shRNA,转染到脐静脉内皮细胞后组织因子的表达受到明显抑制.结论 成功构建出凝血途径的人组织因子基因RNA干扰载体,为研究组织因子基因RNA干扰载体在凝血疾病中的应用提供了稳定的转染细胞载体.     

绿色荧光蛋白报告基因与ZNF580基因重组真核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建具有绿色荧光蛋白报告 (GFP)基因的ZNF5 80真核表达载体 ,为转染细胞提供基础。【方法】根据ZNF5 80cDNA序列的开读框架设计上、下游引物 ,利用PCR技术扩增ZNF5 80cDNA开放阅读框序列 ,将PCR目的片段与PGEM T载体连接并克隆 ,酶切含目的片段PGEM T质粒及 pEGFP C1载体 ,回收纯化后做定向克隆连接 ,BglⅡ及HindⅢ双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】酶切 pEGFP C1 ZNF5 80 ,电泳分析插入片段长度为 :5 2 4bp ,与预期的结果一致 ,经连接点两端进行测序 ,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建真核表达载体pEGFP C1 ZNF5 80。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。     

Construction and application of gene targeting replacement vector for mouse coagulation factor IX gene

Embryonicstem(ES)cellgenetargetingisoneofthemostwidelyusedbiotechniquesinmodernbiology.BasedonthehomologousrecombinationbetweentheendogenoushomologoussequencesandthegenomicDNAfragmentsinthevectorintroducedintoEScells,genetargetingallowsprecise,predeterminedchangesormodificationofthestructureorcontentsofthehostgenometobemade[IJ.ThephenotypiceffectsofthetargetedmodificationalsocanbeexpressedonwholeanimalbyES--blastocysttransferringandchimericbreedingprocedures.Theconstructsoftargetingvectori…     

新型大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体的构建及卡那霉素抗性基因表达的研究

用 PCR（polymerase chain reaction）技术克隆了卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,BCG）热休克蛋白 65（heat shock Protein 65, hsp65）启动子序列,构建成穿梭载体ME-65。该载体含有分枝杆菌和大肠杆菌的质粒复制基因、BCG的hsp65高效启动子序列以及在分枝杆菌和大肠杆菌中都能表达的卡那霉素抗性基因。将其转化到耻垢分枝杆菌和BCG中均可稳定复制并表达卡那霉素抗性。质粒对宿主菌的生长无明显的影响,未观察到质粒的丢失和突变。该载体具有分子量小、容量大、转化效率高、复制稳定、含有多克隆位点等优点,将外源基因插入到hsp65启动子的下游,可望在BCG中获得高效表达。为BCG和其它分枝杆菌发展成多价重组疫苗开辟了新途径。     

四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素（4 mg•L^-1）,利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。     

High efficient generation of replication-defective adenoviruses containing thymidine kinase by homogeneous recombination in bacteria

Background Suicide gene therapy is a widely used molecular treatment for head and neck cancer. In this study, we try to use the method of homogenous recombination in bacteria to clone thymidine kinase gene (tk)–a kind of suicide gene to adenovirus backbone vectors for the construction of replication-defective adenoviruses. Methods pAdTrack-CMV/tk was constructed through subclone of a restriction endonuclease fragment including thymidine kinase gene from plasmid pCMV-tk to another plasmid pAdTrack-CMV, and then co-transfected with supercoiled pAdEasy-1, which was an adenoviral backbone vector except for deletions of E1 and E3, to competent E. coli BJ5183 for homogenous recombination using electroporation procedure. With the same method, pAdTrack-CMV was also co-transformed with pAdEasy-1 for homogenous recombination in BJ5183. Identified with restriction endonuclease PacI and polymerase chain reaction (PCR), plasmids pAd-GFP/tk and pAd-GFP were successfully constructed. Each of them was digested with PacI and sequently transfected into human embryo kidney 293 cells (HEK293) using Lipofectamine 2000.Results Comet-like adenovirus-producing foci of Ad-GFP/tk and Ad-GFP were observed after 5 to 7 days of cell culture. After twelve days of packaging, the replication-defective adenoviruses were collected. Identified with PCR, thymidine kinase gene was successfully constructed into Ad-GFP/tk.Conclusion The replication-defective adenoviruses containing thymidine kinase can be constructed more easily by homogenous recombination in bacteria than conventional techniques.     

PRL-3基因的克隆及其原核表达载体的构建表达

目的 克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体.方法 设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3 cDNA.经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3.结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白.结论 获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础.