基于PKA依赖cAMP信号介导肺胃SP表达探讨中医肺胃相关理论的机制研究

目的观察胃食管反流模型大鼠肺、胃、食管组织中蛋白激酶A(PKA)、环磷酸腺苷(cAMP)、P物质(SP)的表达量,探讨中医肺胃相关理论的分子机制。方法将12只SD大鼠随机数字表法分为正常对照组(n=6)和模型组(n=6),模型组大鼠麻醉后经口插胃管至食管的中下段,以8滴/min的速率缓慢灌注0.1 mmol/L盐酸(含0.5%胃蛋白酶)溶液,每次20 min,1次/d,连续14 d。正常对照组采用PBS液代替,方法同模型组。提取食管、胃和肺组织标本进行病理学观察,用免疫组化法测定PKA、cAMP、SP表达,并将结果进行线性回归分析。结果与正常对照组比较,模型组大鼠肺、胃及食管组织HE半定量评分显著升高[(3.67±0.52)分比(0.00±0.00)分、(3.83±0.41)分比(0.00±0.00)分、(3.83±0.41)分比(0.00±0.00)分,P均<0.01]。与正常对照组比较,模型组大鼠肺、食管、胃组织的PKA蛋白表达量[(0.23±0.02)比(0.15±0.01)、(0.22±0.02)比(0.17±0.02)、(0.24±0.02)比(0.16±0.01),P均<0.01]、cAMP蛋白表达量[(0.20±0.02)比(0.15±0.02)、(0.24±0.03)比(0.15±0.02)、(0.25±0.03)比(0.17±0.02),P均<0.01]、SP蛋白表达量[(0.21±0.02)比(0.15±0.01)、(0.25±0.03)比(0.14±0.02)、(0.33±0.04)比(0.18±0.02),P均<0.01]均显著升高。线性回归结果表明,模型组大鼠胃与肺组织的PKA和SP平均光密度呈线性相关。结论激活后的PKA/cAMP是促进肺胃组织释放SP的重要通路,可能介导了胃食管反流咳嗽的病理生理过程,是肺胃相关理论可能的分子机制之一。     

九香止泻片对湿热型泄泻肠易激综合征模型大鼠AQP4、PKA与cAMP表达的影响

目的探讨九香止泻片对湿热型泄泻肠易激综合征(IBS)模型大鼠肠道水通道蛋白4(AQP4)、cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)与环腺苷酸(cAMP)的影响。方法 40只SD大鼠,随机分为空白组、模型组、九香止泻片组、盐酸洛哌丁胺对照组,每组10只,除空白组外,其余各组大鼠在造模成功后分别给予不同药物或蒸馏水连续灌胃7 d,腹腔麻醉取血处死后取结肠组织测定大鼠肠道AQP4、PKA表达与cAMP含量。结果与空白组比较,模型组肠道AQP4、PKA蛋白表达均显著降低(P<0.05),cAMP含量下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,九香止泻片组和盐酸洛哌丁胺对照组肠道AQP4、PKA蛋白表达均显著增强(P<0.05),cAMP含量显著增加(P<0.05);九香止泻片组和盐酸洛哌丁胺对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论九香止泻片可能通过激活cAMP-PKA信号通路调控湿热型泄泻IBS模型大鼠肠道中AQP4的表达进而改善腹泻症状,是治疗湿热型泄泻IBS的有效方药。     

大建中汤对脾阳虚疼痛大鼠COX-2mRNA及蛋白和CaMKⅡmRNA的影响

【目的】观察大建中汤对脾阳虚疼痛大鼠脑组织环氧合酶-2(COX-2)m RNA及蛋白和钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(Ca MKⅡ)m RNA的影响,探讨大建中汤对脾阳虚疼痛的作用机理。【方法】将SD大鼠40只随机分为正常组,模型组,大建中汤高、低剂量组(剂量分别为3、0.75 g·kg~(-1)·d~(-1))各10只,采用综合造模法复制脾虚动物模型,根据实验分组以灌胃形式连续给药15 d后,断颈处死大鼠并立即取脑组织。采用Real-time PCR法检测脑组织COX-2 m RNA、Ca MKⅡm RNA表达的变化;免疫组织化学法检测COX-2蛋白表达变化。【结果】与正常组比较,脾阳虚模型组大鼠大脑COX-2 m RNA及蛋白表达显著增加(P0.01),Ca MKⅡm RNA表达显著降低(P0.01);大建中汤高、低剂量组COX-2 m RNA与蛋白表达较模型组显著下降(P0.01),Ca MKⅡm RNA表达较模型组显著升高(P0.01)。【结论】大建中汤可通过抑制脾阳虚疼痛大鼠脑组织中COX-2 m RNA及蛋白表达,提高Ca MKⅡm RNA表达来达到治疗疼痛的目的。     

Effect of saponins of Rhizoma Polygonati on the pathway of 5-HT1AR/cAMP/PKA/CREB in rats with chronic stress induced depression

目的 探讨黄精皂苷(SRP)对慢性应激抑郁模型大鼠行为学的影响及部分机制.方法 SD大鼠60只随机分为6组:正常组、模型组、SRP(100、200、400 mg/kg) 组和氟西汀(2 mg/kg)组.采用不同应激方法 建立大鼠慢性应激抑郁模型,观察大鼠行为学指标变化,放射免疫法测定海马环腺苷酸(cAMP)含量,免疫组化法测定海马5-羟色胺受体(5-HT1AR)、蛋白激酶A(PKA)、反应元件结合蛋白(CREB)蛋白表达水平.结果 应激刺激后,与正常组相比,模型组大鼠自主活动次数减少,体重降低,糖水消耗减少,处于抑郁状态.免疫组化结果 显示,与正常组比较,模型组海马5- HT1AR、cAMP、PKA、CREB表达显著降低,SRP组5-HT1AR、cAMP、PKA、CREB表达显著上调(P＜0.01).结论 SRP对慢性应激抑郁大鼠的行为学有改善作用,可能是通过调节5-HT1AR/cAMP/PKA/CREB信号通路发挥抗抑郁作用.     

脾虚1号方对功能性消化不良脾虚证大鼠胃体组织MLC蛋白与基因表达的影响

目的探讨功能性消化不良(FD)脾虚证大鼠胃体组织肌球蛋白轻链(MLC)蛋白与mRNA表达及脾虚1号方的干预作用。方法 60只7 d龄雄性SD大鼠随机分为正常对照组(n=10)、FD脾虚证模型组(n=50)。正常组给予2%蔗糖溶液灌胃,FD脾虚证模型组给予0.1%蔗糖碘乙酰胺溶液灌胃,0.2 m L/(只·d),连续6 d。FD脾虚证模型组正常饲料喂养至6周龄后叠加改良小平台站立,连续14 d。造模结束后随机分为模型组、多潘立酮组、脾虚1号方低、中、高剂量组,各10只,连同正常组,分别给予蒸馏水10 m L/(kg·d)、多潘立酮3.125 mg/(kg·d)、脾虚1号方1.275、2.550、5.100 g/(kg·d),灌胃14 d。采用免疫组化、蛋白质印迹(Western blot)和RT-PCR方法检测胃体组织MLC蛋白及mRNA表达量。结果与正常组相比,免疫组化检测模型组大鼠胃体肌层MLC蛋白定位表达降低;Western blot检测模型组胃体组织MLC蛋白表达量降低;RT-PCR检测模型组大鼠胃体组织MLC mRNA表达量降低,差异均有统计学意义(P0.01)。与模型组相比,免疫组化检测脾虚1号方低、中、高剂量组大鼠胃体肌层MLC蛋白定位表达增加,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01);Western blot检测脾虚1号方中、高剂量组大鼠胃体MLC蛋白表达量增加,差异均有统计学意义(P0.01);RT-PCR检测脾虚1号方高剂量组MLC mRNA表达量升高,差异有统计学意义(P0.01)。结论 FD脾虚证模型大鼠存在胃体组织MLC蛋白及基因表达的降低,而脾虚1号方能够上调MLC蛋白及基因的表达。     

电针对脾气虚大鼠肝组织细胞凋亡的影响

目的:从组织氧化与抗氧化损伤方面,观察电针对脾气虚大鼠肝组织细胞凋亡的影响,探讨电针治疗脾虚证的机理.方法:采用饥饱失常加劳倦过度法复制脾气虚模型;采用HE染色法检测大鼠肝组织细胞形态的变化,比色法检测实验大鼠肝组织丙二醛(Malondial dehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性,TUENL法定量检测实验大鼠肝组织细胞凋亡的表达.结果:脾气虚模型组大鼠肝组织中SOD活力较正常对照组明显下降(P＜0.01),MDA含量较正常对照组显著上升(P＜0.01);同时,脾气虚模型组细胞凋亡指数显著高于正常对照组(P＜0.01).电针治疗能上调肝组织中SOD活力,下调MDA含量,降低组织细胞凋亡数.结论:电针治疗脾虚证的机理可能与抗过氧化损伤,抗组织细胞凋亡的作用有关.     

黄精皂苷对慢性应激抑郁大鼠海马5-HT1AR/cAMP/PKA信号通路的影响

目的探讨黄精皂苷(SRP)对慢性应激抑郁模型大鼠行为学的影响及部分机制。方法 SD大鼠60只随机分为6组:正常组、模型组、SRP(100、200、400 mg/kg)组和氟西汀(2 mg/kg)组。采用不同应激方法建立大鼠慢性应激抑郁模型,观察大鼠行为学指标变化,放射免疫法测定海马环腺苷酸(cAMP)含量,免疫组化法测定海马5-羟色胺受体(5-HT1AR)、蛋白激酶A(PKA)、反应元件结合蛋白(CREB)蛋白表达水平。结果应激刺激后,与正常组相比,模型组大鼠自主活动次数减少,体重降低,糖水消耗减少,处于抑郁状态。免疫组化结果显示,与正常组比较,模型组海马5-HT1AR、cAMP、PKA、CREB表达显著降低,SRP组5-HT1AR、cAMP、PKA、CREB表达显著上调(P<0.01)。结论 SRP对慢性应激抑郁大鼠的行为学有改善作用,可能是通过调节5-HT1AR/cAMP/PKA/CREB信号通路发挥抗抑郁作用。     

腹水草对人胃上皮细胞GES-1的保护作用及其对PKA、CREB、AQP1的调控研究

[目的]研究腹水草(Veronicastrum axillare,V.axillare)含药血清对乙醇损伤的人胃上皮细胞(gastric epithelial cells-1,GES-1)的保护作用及其对环腺苷酸依赖性激酶(protein kinase A,PKA)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP-response element binding protein,CREB)、水通道蛋白1(aquaporin 1,AQP1)表达水平的调控作用。[方法]20只雄性SD大鼠随机分为5组(n=4),连续灌胃给药14d,制备正常组(生理盐水20 m L·kg-1)、雷尼替丁组(0.027g·kg-1)以及V.axillare低、中、高剂量组(0.7、1.4、2.8 g·kg-1)含药血清。MTT法检测体外培养的GES-1细胞的活性,研究V.axillare含药血清及PKA抑制剂H-89(25μmol·m L-1)预处理对5%乙醇诱导GES-1细胞活力的影响。荧光定量RT-PCR检测PKA、CREB及AQP1 m RNA的表达水平,Western blot检测AQP1蛋白表达水平。[结果]模型组和H-89组GES-1细胞活性低于正常组,差异有统计学意义(P0.01);乙醇造模处理显著上调PKA、CREB及下调AQP1的表达水平,差异有统计学意义(P0.01);H-89处理显著抑制PKA和CREB m RNA表达水平(P0.01);加入各剂量V.axillare含药血清不能显著改善H-89对PKA、CREB和AQP1 m RNA表达水平的抑制作用。V.axillare中、高剂量含药血清细胞活性高于模型组,PKA、CREB m RNA表达水平低于模型组,差异有统计学意义(P0.01),而V.axillare中、低剂量含药血清AQP1表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P0.01)。[结论]V.axillare含药血清显著减轻乙醇对GES-1细胞的损伤,对GES-1细胞具有保护作用,其保护机制与下调PKA、CREB及上调AQP1的表达有关。     

辛热药仙茅作用于药物代谢酶CYP3A的药性表达研究

目的在观察仙茅对虚寒大鼠神经内分泌功能改善基础上,探讨辛热药仙茅对虚寒状态动物肝脏药物代谢酶的影响及在辛热药性表达中的意义。方法将SD大鼠随机分为空白对照组,虚寒模型组,仙茅大、中、小剂量组。以氢化可的松(3.75 mg/kg)肌肉注射复制虚寒大鼠模型,辛热药仙茅以30、20、10 g/kg干预,红霉素-N脱甲基法检测动物肝脏代谢酶细胞色素P4503A(CYP3A)活性,放免法检测动物血浆环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)含量,Western blot法检测动物肝脏孕烷X受体(PXR)蛋白表达,免疫组化法检测动物肝脏蛋白激酶A(PKA)蛋白表达。结果虚寒大鼠肝脏药物代谢酶活性降低,PXR表达减少,cAMP、cGMP水平降低,PKA表达减少,仙茅各剂量组可提高CYP3A活性和cAMP含量,增强PXR、PKA表达,对cGMP影响不大。结论仙茅可能通过调节cAMP-PKA信号通路改善虚寒状态的代谢功能低下症状,从而表明辛热药的部分药性实质。     

多巴胺D4受体对酒精依赖大鼠海马区cAMP/PKA通路的影响

目的探讨多巴胺D4受体（DRD4）对酒精依赖大鼠海马区cAMP/PKA通路的调控作用。方法34只雄性SD大鼠,双瓶连续饮用10%乙醇制备酒精依赖模型,将建模成功大鼠根据DRD4 siRNA体内转染情况按随机数字表法分为4组,包括模型对照组、空白对照组（SD-No siRNA）、阴性对照组（SD-Ctr siRNA）和DRD4 siRNA低表达组（SD-DRD4 siRNA）,采用qPCR和Western blotting检测DRD4、腺苷酸环化酶（AC）、cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）等指标的mRNA和蛋白表达。结果与正常对照组比较,模型对照组DRD4 mRNA及蛋白均明显升高（P < 0.01）,AC、PKA、CREB mRNA及蛋白均明显下降（P < 0.01）。在体内转染24 h后,SD-DRD4 siRNA组DRD4、CREB mRNA及蛋白表达水平均低于SD-No siRNA组和SD-Ctr siRNA组（P < 0.01）,AC、PKA mRNA及蛋白表达水平均高于siRNA组和SD-Ctr siRNA组（P < 0.01）。结论DRD4可能通过介导cAMP/PKA通路在酒精依赖的神经生物学机制中发挥重要作用。