GST－IL－1融合基因表达的研究

为研究基因表达的影响因素，将人白细胞介素－１（ＩＬ－１）ｃＤＮＡ的不同片段分别重组入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ中ＧＳＴ基因３￣’端，形成ＧＳＴ－ＩＬ－１融合基因，经ＩＰＴＧ诱导后，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达情况，结果发现ＧＳＴ与全长８１６ｂｐ完整的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因未见有相应蛋白质的表达，且亦未见ＧＳＴ的表达，而ＧＳＴ与５￣’端缺失１８９ｂｐ的ＩＬ－１ｃＤＮＡ的融合基因则看到有相应蛋白质的表达，表达量占细菌蛋白总量的３０％．表明ＩＬ－１ｃＤＮＡ５￣’端１～１８９ｂｐ的序列影响了整个融合基因的表达，即目的基因中远离翻译起始码ＡＵＧ的下游序列也可显著影响该基因的表达．此结果为基因工程中克隆基因表达调控的研究提供了有益的资料     

高密度培养大肠杆菌TG1/pGEX-hCT和高表达重组人降钙素

目的：高密度、高表达培养重组大肠杆菌ＴＧ１／ｐＧＥＸ－ｈＣＴ,生长重组人降钙素（ｒｈＣＴ）。方法与结果：应用ＮＢＳ ＢｉｏＦｌｏ３０００型５Ｌ自控发酵罐,采用分批培养和补料分批培养相结合的培养技术,控制碳源和氮源的补加,控制溶解氧,使重组菌Ｅ．ｃｏｔｉ ＴＧ１／ｐＧＥＸ ｈＣＴ发酵光密度（Ｄ（６００））达到５８．６,人降钙素和ＧＳＴ融合蛋白（ＧＳＴ－ｈＣＴ）的含量达到３．２ｇ／Ｌ。结论：本研究为工     

新型降钙素基因工程菌高表达发酵条件的研究

对新型降钙素基因工程菌ｎＣＴ／ｐＧＥＸ－２Ｔ／Ｅ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１高表达发酵条件进行了优化研究。研究表明重组工程菌遗传性状稳定,采用ＬＢ培养基,１％接种量,当菌体浓度到达Ａ６００ｎｍ０．６时,添加诱导剂ＩＰＴＧ至终浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ。３７℃培养４ｈ,可使含新型降钙素的融合蛋白高效表达,融合蛋白占菌体总蛋白的３５％,２０Ｌ发酵罐中采用上述条件发酵培养,融合蛋白亦可高效表达（３２％）,其菌体密     

人促红细胞生成素在大肠杆菌中融合高表达：稀有密码子对…

本实验分别用两种融合表达载体（ｐＧＥＸ－２Ｔ及ｐＤＳ－６Ｈ）在大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中表达人促红细胞生成素（ｈ－ＥＰＯ）。结果发现，虽然ｈ－ＥＰＯ基因中大肠杆菌使用频率为０％或１％的密码子占密码子总量的１４．３％，但实验中却取得了较高的蛋白表达量。ｐＧＥＸ－２Ｔ和ｐＤＳ－６Ｈ中表达的融合蛋白（分子量：４４４００和２３８００）分别占细菌总蛋白的２９．７％和１７．５％。从而提示，一个基因中的密码子使     

人促红细胞生成素在大肠杆菌中融合高表达：稀有密码子对外源蛋白翻译速率的影响

本实验分别用两种融合表达载体（ｐＧＥＸ－２Ｔ及ｐＤＳ－６Ｈ）在大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中表达人促红细胞生成素（ｈ－ＥＰＯ）。结果发现，虽然ｈ－ＥＰＯ基因中大肠杆菌使用频率为０％或１％的密码子占密码子总量的１４．３％，但实验中却取得了较高的蛋白表达量。ｐＧＥＸ－２Ｔ和ｐＤＳ－６Ｈ中表达的融合蛋白（分子量：４４４００和２３８００）分别占细菌总蛋白的２９．７％和１７．５％。从而提示，一个基因中的密码子使用频率与翻译延长速率之间可能不是一种简单的对应关系。表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ中５＇融合基因长度达１３００ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ中仅为３６ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ但两者表达水平却无显著差异，因此作为翻译起始限制因素的翻译起始区的ＡＴＧ下游顺序仅需长约３６个核苷酸。     

谷胱甘肽S—转移酶及同工酶在原发性肝癌中的表达

应用免疫组化方法，对３２例人肝细胞肝癌的谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴｓ）及同工酶进行原位检测，并以γ－谷氨酰转肽酶（γ－ＧＴ）作为对照，同时检测１１例肝硬化组织的ＧＳＴｓ酸性同工酶ＧＳＴ－π。结果显示，人肝细胞肝癌的ＧＳＴ－π阳性检出率高于肝硬化组织，尤其在高分化肝细胞肝癌中呈过量表达（８５％）；同时，肝细胞肝癌组织的ＧＳＴ－π阳性率显著高于γ－ＧＴ阳性率。提示ＧＳＴ－π有望成为人肝细胞肝癌的一种新的标志酶。     

百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达,并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基,将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端,构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）,可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清,为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统,一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化,得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。为百日咳疫苗的发展提供了依据     

大鼠ACAT的N末端片段(氨基酸1～126)在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的： 重组法制备纯化乙酰辅酶Ａ：胆固醇酰基转移酶（ＡＣＡＴ）Ｎ末端膜外结构域（氨基酸１～１２６）。　方法：经ＰＣＲ扩增得到的ＡＣＡＴ的Ｎ末端膜外结构域（氨基酸１～１２６）用ＥｃｏＲＩ酶解,插入到表达载体ｐＧＥＸ－２ＴＫ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－２ＴＫ／ＡＣＡＴ（氨基酸１～１２６）。阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－Ａ－ＣＡＴ（氨基酸１～１２６）,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ亲和柱纯化。　结果：ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析显示得到了纯的ＧＳＴ－ＡＣＡＴ（氨基酸１～１２６）融合蛋白。　结论：ＡＣＡＴ的Ｎ末端膜外结构域（氨基酸１～１２６）的分离纯化为抗ＧＳＴ－ＡＣＡＴ（Ｎ 末端片段）抗体的制备及其ＡＣＡＴ结构和功能关系的进一步研究打下了基础。     

汉滩病毒核蛋白在大肠杆菌中高效表达

提高汉滩病毒核蛋白的表达量，进一步研究核蛋白的功能，并利用其建立ＨＦＲＳ的血清学诊断方法。利用已有的含ＰＲＰＬ启动子的汉滩病毒核蛋白编码区的表达载体－Ｓ２２，通过酶切和连接的方法，将汉滩病毒Ｓ片段核蛋白的编码区基因插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１和ＧＳＴ基因的３’末端，构建了一种表达核蛋白的融合质粒－ｐＴＨａｎＳ。结果；经薄层扫描仪扫描，ｐＴＨａｎＳ核蛋白的表达量占细胞总蛋白量的３２％。并对     

人黑色素瘤单抗VH—TNF融合蛋白基因的构建和表达

在大肠杆菌中表达人黑色素瘤单抗ＶＨ－ＴＮＦ融合蛋白基因。方法；在人肿瘤坏死因子基因上游插入了抗黑色素瘤单抗Ｍｅｌ３的重链可变区基因，将此融合基因插入大肠杆菌表达系统ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＧＳＴ基因下游，ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物经凝血酶消化后，测定其对Ｌ９２９细胞的杀伤活性，并进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，用抗ＴＮＦ抗体进行蛋白印迹分析。     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。