5-AzaDc诱导孕酮受体基因启动子脱甲基化可能与DNMT1表达下调有关

目的 探讨5-杂氮-2'-脱氧胞苷诱导DNA脱甲基化可能机制.方法 用5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理白血病细胞株HL-60、K562和Jukat,分析处理前后DNA甲基转移酶1 mRNA表达和孕酮受体双启动子(PRA、PRB)甲基化状态的变化.结果 5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理白血病细胞株后,PRA、PRB都发生脱甲基化作用,DNA甲基转移酶1 mRNA较处理前显著降低(P＜0.01).结论 5-杂氮-2'-脱氧胞苷诱导DNA脱甲基化可能与其降低DNA甲基转移酶1 mRNA表达有关.     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响

目的：探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响．．方法：采用脂质体介导乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染人胃癌细胞株SGC7901细胞，以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后乙酰肝素酶mRNA、Fas mRNA和Bcl-2 mRNA表达的变化，采用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果：脂质体介导转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸后，SGC7901胃癌细胞内乙酰肝素酶mRNA和Bcl-2 mRNA表达下降，FasmRNA表达上升，凋亡细胞比率由转染前的4．04％增加至转染后的16．00％。结论：转染后的乙酰肝素酶反义寡核苷酸可有效地诱导胃癌细胞发生凋亡。     

脂质体介导的99mTc标记c-myc mRNA反义寡核苷酸的反义作用效果的研究

目的探讨脂质体介导的99mTc标记癌基因c-myc mRNA的反义寡核苷酸能否抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.方法合成15 bp的癌基因c-myc mRNA的反义、正义及无义寡核苷酸,用99mTc标记后(简称99mTc-DNA),一部分用脂质体包裹,以不同放射性强度的99mTc-DNA及脂质体包裹的99mTc-DNA转染细胞,于转染后不同时间测定细胞摄取率,在转染后18 h测定细胞返流比率,用四唑盐比色实验检测反义抑制细胞的生长状况,用流式细胞术测定癌蛋白的表达.结果在1～5 h内,细胞的摄取率随时间的延长而增加,脂质体包裹的99mTc-DNA的细胞摄取率明显高于未用脂质体包裹的99mTc-DNA.四唑盐比色实验,随着脂质体介导的99mTc-反义DNA剂量的增加,细胞数量逐渐减少,而正义、无义寡聚核苷酸组,细胞数量则没有减少的趋势.细胞的返流比率,反义、正义、无义寡核苷酸分别为39.51%、44.12%、63.92%.测定癌蛋白的荧光强度,反义寡核苷酸组2.9860±0.3733、正义寡核苷酸组4.2600±0.2218、无义寡核苷酸组5.2620±0.8562,反义寡聚核苷酸组的荧光强度明显低于正义和无义寡聚核苷酸组.结论脂质体介导的99mTc标记的反义寡核苷酸能抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.     

Chk1反义寡核苷酸影响胶质瘤放疗敏感性的研究

目的:观察转染Chk1反义寡核苷酸(ASON)后,对照射后U251细胞株中Chk1表达、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,Chkl的正义、反义寡核苷酸对U251细胞株进行Chkl转染。以放射线照射后,测定其细胞周期和凋亡率变化,比较Chkl转染正义链和反义链对细胞放射敏感性的不同。用WesternBlot法检测Chk1蛋白,RealtimePCR检测Chk1mRNA表达。结果:转染Chk1反义寡核苷酸后,能明显下调Chk1蛋白和mRNA的表达,显著增强放射线诱导的肿瘤细胞凋亡,并消除细胞周期阻滞。结论:反义核酸技术灭活Chk1基因显著增强放疗诱导的U251细胞凋亡,为增敏胶质瘤的放射治疗提供了理论依据。     

siRNAi沉默DNMT1基因对肺癌细胞WIF-1启动子甲基化的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶(DNMT1)siRNAi对人肺癌A549细胞内抑癌基因wnt抑制因子-1(WIF-1)基因启动子高甲基化的影响.方法 利用pSilencer 4.1-CMV neo载体,通过siRNAi表达载体法制备DNMT1 siRNAi.将DNMT1 siRNAi转染肺癌A549细胞,采用RT-PCR和Western blot检测观察转染前后肺癌A549细胞DNMT1内DNMT1基因的表达改变,并利用甲基化PCR,直接测序法检测WIF-1基因启动子甲基化水平.结果 构建的DNMT1 siRNAi转染肺癌A549细胞后,明显抑制DNMT1基因的表达,mRNA表达下降75%,蛋白表达下调82%;同时,WIF-1基因启动子序列较转染前甲基化水平明显降低.结论 靶向DNMT1的siRNAi可明显下调靶基因DNMT1的表达,并逆转WIF-1基因启动子高甲基化水平.     

反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体联合转染对人胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体对人胆管癌细胞株QBC-939的增殖能力和细胞凋亡的影响。方法分别构建反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达载体,脂质体介导法将二者先后转染入QBC-939,经G418筛选和荧光细胞克隆挑选得到稳定转染细胞株,并用Western blot检测转染前后的蛋白表达变化;用MTT法和软琼脂克隆形成试验观察各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞生长周期及凋亡率的变化。结果Western blot检测证实转染反义基因能使相应蛋白表达水平降低;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因能影响QBC-939的生长曲线,使细胞增殖减慢,并以前者为甚;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因的细胞克隆形成率分别为(6.78±0.89)%和(14.86±2.13)%,明显低于未转染组;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G1期,细胞凋亡率从(1.63±0.27)%分别增加到(18.47±1.46)%和(6.19±0.78)%;在上述效应检测中,单独转染反义DNMT3b基因实验组对QBC-939细胞的生长无明显影响。结论通过联合转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达载体,能抑制胆管癌细胞的生长和增殖,并促进凋亡的发生,其效果明显优于单独转染DNMT1反义基因;在DNA甲基化的过程中,DNMT1起着主要的作用,DNMT3b扮演着协同的角色,二者通过甲基化途径对胆管癌的发生发挥作用。     

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

目的 构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响.方法 应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMTl反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染人人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化.结果 成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒.转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加.结论 反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标.     

Survivin反义寡核苷酸诱导K562细胞株凋亡的实验研究

目的 探讨Survivin反义寡核苷酸对K562细胞株凋亡的影响.方法 将K562细胞分为四组:反义组、无义组、脂质体组及空白对照组,通过脂质体将Survivin反义寡核苷酸转染入各组K562细胞,用免疫组化法测定转染前后K562细胞Survivin基因及Caspase-3的表达差异,用Tunel及Annexin V-FITC测定各组细胞的凋亡率.结果 Survivin基因在K562细胞高表达,转染反义核苷酸后其表达下降,转染Survivin基因反义核苷酸后Caspase-3的表达较其它各组升高,K562细胞生长受抑,细胞凋亡率升高.结论 Survivin反义寡核苷酸能够下调Survivin基因的表达,促进白血病细胞株K562的凋亡.     

多药耐药相关蛋白-2在白血病耐药细胞株K562/A02的表达

目的:研究多药耐药相关蛋白-2（MRP-2）与白血病细胞耐药的关系,并探讨其在白血病多药耐药中的意义。方法：应用RT-PCR方法检测白血病细胞株K562与耐药细胞株K562/A02中MRP-2 mRNA的差异表达,然后将MRP-2反义及正义寡核苷酸片段分别用脂质体转染至耐药细胞株K562/A02,采用MTT法、流式细胞术及RT-PCR法检测转染后细胞内阿霉素的荧光强度、耐药指数及MRP-2 mRNA的表达情况。结果：耐药细胞株K562/A02中MRP-2 mRNA表达水平明显高于白血病细胞株K562（P<0.05）。MRP-2反义寡核苷酸片段转染后耐药细胞株K562/A02细胞内的阿霉素浓度升高,耐药指数较未转染细胞明显降低（P<0.05）;转染后耐药细胞株K562/A02细胞MRP-2 mRNA表达水平较未转染细胞下降了67.5%,两者比较差异具有显著性（P<0.05）。结论：MRP-2的高表达导致白血病耐药细胞内化疗药物浓度降低,可能是其导致白血病多药耐药的机制之一。     

DNMT1蛋白通过沉默MEG3基因促进视网膜母细胞瘤增殖

目的 探讨 DNMT1 蛋白是否通过沉默 MEG3 基因诱导视网膜母细胞瘤增殖。方法 通过转染 pcDNA-DNMT1 或si-DNMT1上调或干扰DNMT1的表达水平;通过转染pcDNA-MEG3或si-MEG3上调或干扰MEG3的表达水平;用Western blot检测视网膜母细胞瘤细胞系中DNMT1蛋白表达量;用CCK-8法及EdU法检测细胞的增殖能力;用实时荧光定量PCR技术检测转染后的视网膜母细胞瘤细胞中MEG3表达量的变化;干扰DNMT1表达后,用甲基化特异性PCR检测MEG3基因启动子DNA甲基化水平的变化。结果 视网膜母细胞瘤SO-RB50及HXO-RB44细胞中DNMT1蛋白表达量显著升高（P<0.05）。转染了 pcDNA-DNMT1 的 HXO-RB44 细胞中 DNMT1 蛋白表达增加,细胞增殖能力增加,MEG3 表达量降低;转染了 siRNADNMT1的SO-RB50细胞DNMT1蛋白表达减少,细胞增殖能力降低,MEG3表达量增加（P<0.05）。干扰DNMT1蛋白表达后,MEG3基因启动子DNA甲基化水平降低（P<0.05）。逆转DNMT1蛋白对MEG3基因的调控后,DNMT1蛋白调控RB细胞增殖的能力减弱（P<0.05）。结论 在视网膜母细胞瘤细胞中,DNMT1蛋白表达的上调,诱导了MEG3基因启动子DNA甲基化失活,最终导致细胞异常增殖。     

人DNA MTase反义基因转染诱导E-Cadherin基因启动子区域去甲基化

目的：观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721E－Cadherin基因启动子区域甲基化状态的影响。方法：采用脂质体法将已构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；用甲基化特异的PCR法检测E－Cadherin基因启动子区域甲基化状态的改变，结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂体法成功将重组载体转染入细胞，甲基化特异的PCR法检测显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞中的E－Cadherin基因启动子区域呈现去甲基化状态。结论：人DNA MTase反义基因片段可诱导E－Cadherin基因启动子区域去甲基化，实验结果有助于进一步了解DNA MTase在肝癌发展中的作用。     

人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞DNA MTase基因mRNA表达的影响

目的：观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721内源性DNA MTase基因mRNA的表达的影响。方法：将将建的包含正、反义DNA MTase基因片段的真核表达载体用脂质体法将其转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用RT－PCR法观察DNA MTase基因mRNA表达变化。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实证用脂质体法成功将重组载体转染入细胞：RT－PCR法检测DNA MTase基因mRNA表达，显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞中DNA MTase基因mRNA表达下调。结论：人DNA MTase基因反义基因转染是一种有效，可靠的抑制肝癌细胞系SMMC－7721DNA MTase基因表达的方法。它为更多了解DNA MTase在肝癌发生的作用提供了帮助。     

脂质体介导ANG反义核酸对 A549 细胞作用的研究

目的：研究脂质体介导ANG反义核酸转染A549细胞后，对其中ANG蛋白表达的影响。探讨其作为抗血管生成与抗肿瘤药物的可行性。方法：用人工合成的人ANG反义寡聚核苷酸，以脂质体为载体转染人肺癌A549细胞，研究A549细胞在基因转染后，其ANG蛋白表达的变化。结果：脂质体转染程序优化后，得到最佳转染效率，免疫组化显示细胞内ANG蛋白表达明显减少，培养基ELISA检测显示每细胞分泌的ANG蛋白量与对照组相比有显著差异。结论：ANG反义寡聚核苷酸抑制A549细胞中ANG的表达，为体内研究提供了基础。     

BRCA1调节乳腺癌细胞黄体酮受体A和B蛋白的表达

目的 研究BRCA1能否在乳腺癌细胞中调节黄体酮受体A和B的表达.方法 在乳腺癌细胞MCF-7中,用lipofectamine 2000转染含有野生型BRCA1 cDNA的pFlag-CMV2-BRCA1 wt质粒或BRCA1特异性的小干扰RNA,过表达BRCA1或敲低BRCA1的表达.转染24 h以后,加入含有100 nmol/L黄体酮完全培养基刺激24 h.提取全细胞蛋白或总RNA,进行Western blotting和RT-PCR检测BRCA1、黄体酮受体A(PRA)和黄体酮受体B(PRB)在蛋白质水平和mRNA水平的表达.结果 在MCF-7细胞中过表达BRCA1,PRA和PRB蛋白的表达下降,而PRA和PRB在mRNA水平无变化;BRCA1的表达被敲低后,PRA和PRB的表达升高.结论 在乳腺癌细胞中,外源性和内源性BRCA1都可以下调PRA和PRB蛋白的表达.     

子宫内膜异位症孕激素受体B基因失活与CpG甲基化的关系

目的探讨子宫内膜异位症孕激素受体B(progesterone receptor,PRB)基因失活与CpG甲基化的关系。方法采用甲基化PCR法检测62例子宫内膜异位症患者(病例组)和33例宫颈上皮内瘤样变行子宫切除患者(对照组)在位子宫内膜孕激素受体PRA与PRB CpG的甲基化率,免疫组化法测定PRA和PRB的阴性表达率,并分析甲基化与PRA和PRB的阴性表达率的相关性。结果病例组与对照组患者在位子宫内膜PRA的甲基化率间差别无统计学意义(P>0.05),而PRB的甲基化率间差别有统计学意义(P<0.01)。病例组与对照组患者PRA的阳性表达率间差别无统计学意义(P>0.05),而PRB的阳性表达率间差别有显著性意义(P<0.01)。病例组患者PRB的甲基化与免疫组化PRB的阴性表达率相关(P<0.01)。结论CpG甲基化可能与子宫内膜异位症患者PRB基因表达缺失而致病有关。     

脂质体介导gp130反义寡核苷酸对PC-3细胞增殖影响的研究

目的:研究脂质体介导gp130反义寡核苷酸对人雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)细胞PC-3体外增殖活性的影响。方法:采用细胞计数及MTT比色法评价反义寡核苷酸对PC-3细胞体外增殖的影响,应用荧光免疫细胞化学法检测gp130基因的蛋白表达情况,流式细胞计数评价其对细胞周期的影响。结果:脂质体介导gp130反义寡核苷酸组与正义寡核苷酸组及对照组比较,PC-3细胞增殖活性受到明显抑制。转染48h后,gp130蛋白表达完全受到抑制,细胞周期明显阻滞于G0/G1期,细胞增殖抑制率为53.7%,细胞凋亡率高达51.28%。结论:脂质体介导gp130反义寡核苷酸可抑制人AIPC细胞PC-3体外增殖活性。应用反义技术为AIPC的基因治疗提供了新的思路和探索。     

生存素反义寡核苷酸对人子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用

 目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对人子宫内膜癌细胞HEC-1B增殖的抑制作用。方法 实验分空白对照组（control组）、单纯脂质体对照组（Lip组）、正义链转染对照组（SODN组）、ASODN转染组（ASODN组）4组。人工合成正、反义寡核苷酸,经脂质体将survivin正、反义寡核苷酸转染入子宫内膜癌细胞48 h后收集各组细胞。免疫印迹（Western blot）法检测各组细胞生存素表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝试验（MTT）法检测细胞生长抑制情况。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的子宫内膜癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降;ASODN转染组细胞凋亡率和增殖抑制率均明显高于各对照组（P<0.05）,而各对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染子宫内膜癌细胞能下调生存素蛋白表达,诱导子宫内膜癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,对子宫内膜癌是一种有效的基因疗法。